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Aus dem physiologischen institut

Aus dem Physiologischen Institut (Geschäftsführender Vorstand: Prof. Dr. med. Bleich) der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel DIE WIRKUNG VON CARBAMAZEPIN AUF NEURONALE
UND EPITHELIALE KCNQ-KANÄLE
Inauguraldissertation Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Olga Haferkamp
Referent: Prof. Dr. Bleich, Physiologisches Institut Korreferent: Prof. Dr. Stephani, Klinik für Neuropädiartie Tag der mündlichen Prüfung: 13.02.2012 Zum Druck genehmigt, Kiel, 13.02.2012 1 Einleitung
1.1 Aufbau und Funktion von Zellmembranen
Jegliche Arten von Zellen sind von einer Membran umgeben, die ihnen Schutz gegenüber ihrer Umgebung bietet. Sie legt die Ausmaße der Zelle fest und ermöglicht lebenswichtige Austauschvorgänge. Alle biologischen Membranen bestehen aus einer zusammenhängenden Doppelschicht aus Phospholipiden, in die verschiedene Membranproteine eingelagert sind. Dabei orientieren sich die hydrophoben Kohlenwasserstoffe der Phospholipide nach innen, während die polaren Kopfgruppen dem wässrigen Medium zugewandt sind. Diese Anordnung verleiht der Zellmembran die abgrenzende Funktion. Die integrierten Membranproteine sind ebenfalls amphiphil und interagieren mit ihren hydrophoben Transmembrandomänen mit dem hydrophoben Inneren der Membran und ihren hydrophilen mit dem wässrigen Milieu sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle. Das hydrophobe Innere der Lipidmatrix fungiert als eine Permeabilitätsbarriere für die meisten polaren Moleküle. Erst Membranproteine wie Rezeptoren, Ionenkanäle und Transporter erlauben einen kontrollierten Ionenfluss und den Transport von polaren Molekülen (Alberts et al., 2003). Damit tragen Membranproteine zur Aufrechterhaltung der intra- und extrazellulären Ionenkonzentrationen bei, regulieren somit die elektrische Erregbarkeit und die osmotische Bilanz. Außerdem steuern sie die Aufnahme von Nährstoffen und den Austritt von Abbauprodukten. 1.2 Ionentransport und Membranpotenzial
Die unterschiedlichen Konzentrationen der verschiedenen Ionen im Intra- und Extrazellulärraum (Tab.1.1) sind Voraussetzungen für die Funktionsfähigkeit der Zellen und werden durch eine Vielzahl von primär (ATP-abhängigen) oder sekundär aktiven Transportprozessen (Ionenaustauscher) aufrechterhalten. Hydrophobe Moleküle, Sauerstoff und Kohlendioxid können die meisten Membranen frei passieren. Für kleine, ungeladene polare Moleküle wie Glyzerol, Wasser und Harnstoff ist die Biomembran in begrenztem Umfang durchlässig. Für Ionen und große ungeladene Moleküle hingegen sind die reinen Lipiddoppelschichten nicht permeabel. Für einen gerichteten Stofftransport über die Membran sind grundsätzlich zwei verschiedene Prozesse zu unterscheiden. Der aktive Transport, der häufig an die Hydrolyse von ATP gekoppelt ist und Substanzen gegen den Konzentrationsgradienten über die Membran pumpen kann und ein passiver Transport, der entlang vorhandener Konzentrationsgradienten transportiert. Dieser passive Transport befördert auch Ionen und geladene Moleküle, wobei dieser Prozess nicht nur vom chemischen Konzentrationsgradienten, sondern auch vom elektrischen Feld abhängt, das sich durch die Potenzialdifferenz über der Membran aufbaut. Zusammengefasst ergibt sich hieraus ein elektrochemischer Gradient als Triebkraft des Substratflusses. Durch das Zusammenspiel von aktiven und passiven Transportprozessen entstehen große Unterschiede in der Zusammensetzung der intrazellulären und extrazellulären Flüssigkeit. Ion Extrazellulär (mM) Intrazellulär (mM) Gleichgewichtspotenzial (mV)
Natrium 135 - 145 12 +66 Kalium 3,5 - 5 140 -93 Calcium 2,25 - 2,52 10-4 +123 Chlorid 115 2,5 – 50 -101 − -20 Tabelle 1.1: Ionenkonzentrationen innerhalb und außerhalb der Zelle und ihr Gleichgewichtspotenzial
(nach Ashcroft, 2000). Die extrazelluläre Konzentration bezieht sich auf das Serum, während die intrazellulären
Angaben die zytosolischen Konzentrationen von Säugetierzellen repräsentieren. Das Gleichgewichtspotenzial wurde für 37°C berechnet. Tabelle 1.1 zeigt die intra- und extrazellulären Konzentrationen für die wichtigsten Ionen. Auffällig ist eine sehr hohe Konzentration von intrazellulärem Kalium gegenüber dem Extrazellulärraum. Die Natriumkonzentration hingegen ist um ein Vielfaches höher außerhalb der Zelle. Durch diese asymmetrische Verteilung der Ionen ergibt sich eine Potenzialdifferenz über der Membran, wenn diese über eine spezifische Permeabilität für ein solches Ion verfügt. Für jede Ionensorte X kann eine Spannung EX berechnet werden, bei der sich die Kräfte für den Einstrom und Ausstrom der Ionen ausgleichen, so dass kein Netto-Ionenfluss über der Membran zu registrieren ist. Dieses Potenzial nennt man auch Gleichgewichtspotenzial oder elektrochemisches Potenzial einer Ionensorte. Nach der Nernst Gleichung (Abb. 1.1) lässt sich dieses Potenzial berechnen. [X ]außen [X ]innen Abbildung 1.1 : Nernst Gleichung. Dabei ist R die allgemeine Gaskonstante (8,314 J K-1 mol-1), T die absolute
Temperatur (310 K bei 37°C), z die Ladung des Ions und F die Faraday-Konstante (96485 C mol-1). [X]außen und
[X]innen stehen für intra- und extrazellulären Aktivitäten (Konzentration mal Aktivitätskoeffizient) eines Ions X.
Berücksichtigt man allerdings, dass die Zellmembran nicht nur für eine Ionensorte permeabel ist und die Permeabilität für verschiedene Ionen auch unterschiedlich sein kann, so erlaubt die Goldman-Gleichung (Abb. 1.2) die Berechnung des Membranpotenzials. Diese Gleichung berücksichtigt für Anionen A und Kationen K unterschiedliche Permeabilitäten P und beruht auf der Annahme, dass Gleichgewichtsbedingungen herrschen. Da Kalium bei Zellen in Ruhe die höchste Permeabilität aufweist, liegt das Ruhemembranpotenzial der meisten Zellen in der Nähe des Kaliumgleichgewichtspotenzials, etwa bei -70mV. ∑ A[ ]außen Abbildung 1.2 : Goldman-Gleichung. Dabei ist R die allgemeine Gaskonstante (8,314 J K-1 mol-1), T die
absolute Temperatur (310 K bei 37°C), z die Ladung des Ions und F die Faraday-Konstante (96485 C mol-1). P
steht für die Permeabilität der Membran für die entsprechenden Ionen. [X]außen und [X]innen stehen für intra- und
extrazellulären Aktivitäten (Konzentration mal Aktivitätskoeffizient) eines Ions X. Die Permeabilität P führt bei gegebenen Ionenkonzentrationen zu einem elektrischen Leitwert G der Membran. Ist die Membran für mehrere Ionenarten permeabel, so ist für die Gleichgewichtseinstellung entscheidend, welchen Anteil die Einzelleitwerte GK, GNa, und GCl am Gesamtleitwert der Membran (Gm) ausmachen. Entsprechend kann für ein Ion X ein fraktioneller Leitwert fx angegeben werden. Die vereinfachte Variante der Goldman-Gleichung lautet dann: Wobei X für die jeweiligen Ionen steht. Diese Formel ermöglicht die Berechnung der Änderung des fraktionellen Leitwertes für Kalium (∆fK) in Abhängigkeit von der Änderung des Membranpotenzials einer Zelle, z.B. einer Oozyte (∆Em). E E Dabei steht EK für das Gleichgewichtspotenzial von Kaliumionen (ca.-90mV) und Ex für das stellvertretende Gleichgewichtspotenzial aller anderen Ionen. Demnach repräsentiert Ex in diesem Beispiel das Membranpotenzial einer mit Wasser injizierten Oozyte (ca.-40mV), die keine Kaliumpermeabilität hat. 1.3 Ionenkanäle
Ionenkanäle sind porenbildende Membranproteine, die das Passieren der Biomembran für geladene Teilchen ermöglichen. Sie kommen in allen Zellen vor und sind z.B. in Nervenzellen für die Generierung von Aktionspotenzialen verantwortlich (Hille, 2001). Verschiedene Öffnungs- und Schließmechanismen, die zu einem charakteristischen Schaltverhalten führen, die Empfindlichkeit gegenüber pharmakologischen Hemmstoffen und die unterschiedliche Ionenselektivität verleihen den Ionenkanälen ihren speziellen Charakter. Anhand dieser Eigenschaften können Ionenkanäle beschrieben und eingeteilt werden. Die direkte Steuerung von Ionenkanälen kann über intrazelluläre Botenstoffe (z.B. Ca2+, cGMP), durch thermische und physikalische Reize, durch Ionen (z.B. Na+, Ca2+, H+), durch Lipide (z.B. Arachidonsäure, PIP2) oder durch Veränderung der Proteinstruktur (z.B. Phosphorylierung, Proteolyse) erfolgen. Darüber hinaus werden bestimmte Ionenkanäle über Liganden gesteuert. Dabei ist der Kanal entweder selbst der Rezeptor oder der Kanal wird über einen G-Protein gekoppelten Rezeptor kontrolliert. Ein Beispiel hierfür ist der muscarinerge M2-Acetylcholinrezeptor. Über M2-Rezeptoren wird am Herzen die Acetylcholinwirkung vermittelt. Bei Aktivierung öffnen sich Kalium-Kanäle und führen zu einer Verlangsamung der diastolischen Depolarisation und somit einer Abnahme der das Membranpotenzial gesteuert. Diese spannungsgesteuerten Ionenkanäle verfügen über einen Sensor, der auf die Spannungsänderung an der Membran mit einer Konformationsänderung reagiert, die zur Öffnung der Pore führt. Diese Proteine haben einen zentralen Stellenwert für die Physiologie von Nervenzellen und werden in den folgenden Kapiteln näher erklärt. 1.4 Kaliumkanäle und das Aktionspotenzial


nicht erregbaren Zellen und sind somit an einer Vielzahl unterschiedlicher Prozesse beteiligt. Durch den Kaliumstrom wird das Membranpotenzial gesteuert und die Repolarisation nach einem Aktionspotenzial reguliert. Des Weiteren sind Kaliumkanäle an der Freisetzung von Hormonen und Neurotransmittern, der Rhythmik des Herzschlages und der elektrischen Erregbarkeit von Neuronen beteiligt. Außerdem spielt der Kaliumtransport eine wichtige Rolle für die osmotische Bilanz der Zelle. Die Aktivierung dieser Kanäle kann durch die Änderung des Membranpotenzials, durch den Zellmetabolismus oder durch Transmitter und Hormone reguliert werden (Hille 2001). Durch die Änderung des Membranpotenzials werden auch die meisten im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Kaliumkanäle aktiviert. In der Membran von Nervenzellen sind auch spannungsabhängige Natriumkanäle integriert. Wenn sich das Potenzial über der Zellmembran infolge einer Reizeinwirkung in positiver Richtung verändert, so sind Natriumkanäle die ersten sich öffnenden Kanalporen. Ist die Reizeinwirkung so stark, dass ein Potenzial von ca. -50mV erreicht wird, so spricht man von einem Schwellenpotenzial, da nun eine lawinenartige Öffnung von weiteren spannungsabhängigen und eine schnelle Membranpotenzials (Abb. 1.3) erfolgt. Abbildung 1.3 : Aktionspotenzial (von Kandel / Schwartz / Jessel)
Diese Verschiebung des Potenzials in Richtung des Natriumgleichgewichtspotenzials wird als Depolarisation bezeichnet und beruht also auf einer sich selbst verstärkenden Öffnung von weiteren Natriumkanälen. Es kommt zu einem Anstieg des fraktionellen Na+- Leitwertes in der Zellmembran, die auf diese Weise bis zu Werten um +30mV depolarisiert. Während die spannungsaktivierten Natriumkanäle bereits nach einer Millisekunde inaktivieren und der Na+-Leitwert wieder auf den Ausgangswert absinkt, steigt etwas verzögert der K+-Leitwert an und beschleunigt die Repolarisation. Wegen der noch anhaltenden Erhöhung des K+- Leitwertes kann es zu einer vorübergehenden Absenkung des Membranpotenzials unter den Ausgangswert kommen, was als Hyperpolarisation bezeichnet wird. Für eine Nervenzelle bedeutet eine derartige Hyperpolarisation, dass sie in dieser Phase nur schwer erregbar ist. Dies begrenzt die Frequenz der Aktionspotenziale, gewährleistet eine vollständige Regeneration der Aktivierbarkeit der spannungsabhänigen Na+ Kanäle und verkürzt die relative Refraktärphase. 1.5 Familie der KCNQ-Kanäle
Eine besondere Klasse der spannungsabhängigen Kaliumkanäle stellen die KCNQ-Kanäle dar. Sie umfassen zum heutigen Zeitpunkt fünf Mitglieder (KCNQ1-5) und sind ebenfalls auch unter der Bezeichnung Kv7.1-5 bekannt. Alle Familienmitglieder dieser Gruppe haben strukturelle Ähnlichkeiten zu anderen spannungsabhängigen Kaliumkanälen mit sechs Transmembrandomänen (S1-S6). Dabei steht dem S4-Transmembransegment eine besondere Aufgabe zu. Diese hochkonservierte Struktur, die in regelmäßigen Abständen innerhalb der α- Helix positiv geladene Aminosäuren enthält, fungiert als Spannungssensor und induziert die Kanalöffnung bei Depolarisation der Membran über einen für den Kanal typischen Wert (Padilla et al. 2009; Panaghie et al. 2007). Desweiteren haben die KCNQ-Kanäle eine einzelne Porenschleife und zytoplasmatische N- und C-Termini. Dabei ist der sehr lange C- Terminus, der eine große Variation zeigt (Jentsch 2000), für eine geringere Homologie der einzelnen Mitglieder innerhalb der Genfamilie verantwortlich. Im Vergleich zu anderen befindet sich im C-Terminus Interaktionsdomäne, die für die Zusammenlagerung der vier α-Untereinheiten essentiell ist (Schwake et al. 2003). Erst durch die Zusammenlagerung von vier α-Untereinheiten, die als Tetramer eine membranintegrierte Pore bilden, entsteht ein funktionstüchtiger Kanal. Lagern sich vier identische Untereinheiten zusammen, so bezeichnet man sie als homomer. Diese Homomere können von allen fünf KCNQ-Mitgliedern gebildet werden. Darüber hinaus sind auch Heteromere in bestimmten Konstellationen möglich. Während KCNQ3 sowohl mit KCNQ2, KCNQ4 und KCNQ5 assoziieren kann, ist KCNQ1 nicht in der Lage mit anderen α- Untereinheiten heteromere Kanäle zu bilden.


Abbildung 1.4: Zentraler Ausschnitt eines
phylogenetischen Baums der „KCN" K+-
Kanalfamilie.
Zur Vereinfachung wurde die
allgemein für K+-Kanäle (KCN) verwendete
Nomenklatur weggelassen. (für KCNE3 steht
z.B. E3). (Modifiziert nach Heitzmann&Warth,
2008).
Zusätzlich können die Kanaleigenschaften durch akzessorische ß-Untereinheiten wie KCNE1 und KCNE3 modifiziert werden. Zu dieser KCNE-Familie gehören fünf Mitglieder (KCNE1- KCNE5), die alle mit KCNQ1 oder KCNQ4 zu Heteromeren assoziieren können. Weitere bekannte Interaktionen sind KCNE1 oder KCNE2 mit KCNQ2 und KCNQ3. Dabei sind alle KCNE-Untereinheiten sehr klein und besitzen nur eine Transmembrandomäne, die einen extrazellulären N- und einen zytosolischen C-Terminus aufweist. Sie haben alleine keine Kanalfunktion. Werden sie aber mit KCNQ-Untereinheiten koexprimiert, kann ein wesentlicher Einfluss auf die biophysikalischen Eigenschaften der Kanäle beobachtet werden (Lundquist et al. 2006). Ungeklärt ist bislang in welchem stöchiometrischen Verhältnis die Assoziation erfolgt. Vorstellbar ist, dass jeweils zwei KCNE-Untereinheiten in ein KCNQ- Tetramer integriert sein könnten, wobei ebenfalls noch ungeklärt ist, ob sie an der Porenbildung beteiligt sind (Melman et al. 2002; Melman et al. 2004; Tapper et al. 2001). Neuere Studien geben den Hinweis, dass die Wechselwirkung der C-Termini zwischen der α- Untereinheit KCNQ1 und der ß-Untereinheit KCNE1 für einen stabilen Komplex verantwortlich sein könnten (Chen et al. 2009). Interessant ist diese KCNQ-Kanalfamilie aber auch auf Grund einer anderen Tatsache. Wenn man bedenkt, dass derzeit über siebzig porenbildende α- und akzessorische ß-Untereinheiten von Kaliumkanälen kloniert und beschrieben sind (Gutman et al. 2005) und dass bisher nur 10 dieser Kaliumkanäle im Zusammenhang mit erblichen Erkrankungen identifiziert worden sind, so stellen diese KCNQ-Kanäle mit bekannten Mutationen in vier Genen dieser Familie (KCNQ1-KCNQ4) eine wirkliche Besonderheit dar (Jentsch et al. 2000). 1.5.1 Physiologische Bedeutung von KCNQ1 und akzessorischen KCNE-Untereinheiten
Die physiologische Bedeutung der KCNQ-Kanäle ist so vielseitig wie ihre funktionelle Vielfalt, da sie in verschiedenen Geweben mit unterschiedlichen Aufgaben exprimiert werden. 1996 wurde als erster der KCNQ1 durch positionelle Klonierung identifiziert (Wang et al. 1996), alle weiteren Familienmitglieder wurden über ihre Homologie zu KCNQ1 kloniert (Biervert et al. 1998; Charlier et al. 1998; Kubisch et al. 1999; Schroeder et al. 2000a; Singh et al. 1998). Zusammen mit der ß-Untereinheit KCNE1 bilden KCNQ1 ein Kanalprotein, das sehr stark im Herzmuskel exprimiert wird und dort für den langsam aktivierbaren Iks-Strom verantwortlich ist. Außerdem ist dieser KCNQ1/KCNE1 Kanalkomplex im Innenohr, in der Niere, Lunge, Bauchspeicheldrüse und in der Plazenta nachzuweisen (Gutman et al. 2005). Eine besondere Aufgabe wird dem Iks-Strom in den Herzmuskelzellen zugeschrieben. Dieser charakteristisch zeitlich verzögerte, langsam aktivierende Strom beschleunigt die Repolarisation der Kardiomyozyten nach einem Aktionspotenzial. Daher ist es auch verständlich, dass Mutationen in einer der beiden Untereinheiten zu angeborenen Herzrhythmusstörungen führen können, die klinisch durch ein verlängertes QT-Intervall im EKG auffällig werden. Diesem verlängerten QT-Intervall liegt eine verzögerte Repolarisation zugrunde, weshalb dieses Phänomen auch als Long-QT-Syndrom bezeichnet wird. Diese Abnormalität in der Repolarisationsphase äußert sich bei den Betroffenen durch Arrhythmien, die sogar zum plötzlichen Bewusstseinsverlust und Herzstillstand führen können. Zu unterscheiden sind dabei zwei Syndrome. Das autosomal-dominant vererbte Romano-Ward- Syndrom und das autosomal-rezessiv vererbte Jervell-Lange-Nielsen-Syndrom (JLNS). Dabei leiden die JLNS-Betroffenen neben der Neigung zu Herzrhythmusstörungen auch an angeborener bilateraler Taubheit, was durch die gestörte Funktion der KCNQ1/KCNE1- Kanäle bei der Endolymphproduktion im Innenohr erklärt werden kann (Rivas et al. 2005; Warth et al. 2002). Die biophysikalischen Eigenschaften des KCNQ1-Kanals werden durch eine Verbindung mit einer anderen ß-Untereinheit, KCNE3, drastisch verändert. Diese Konstellation führt zu einem konstitutiv offenen Kanal, der einen Strom mit linearer Spannungsabhängigkeit vermittelt, einen zeitunabhängigen Verlauf aufweist und durch cAMP aktivierbar ist (Schroeder et al. 2000b). Zu finden ist diese KCNQ1/KCNE3 Koexpression in Kolonkrypten, wo ein großer Zusammenhang zwischen der Aktivität dieser Kanälen und der cAMP- aktivierenden Cl-Sekretion zu belegen ist (Bleich et al. 1997; Greger et al. 1997b; Kunzelmann et al. 2001a; Schroeder et al. 2000b). Einen Überblick liefert das Zellmodell einer Cl- sezernierenden Enterozyte (Abb. 1.5). Zunächst zeigt sich eine sehr unterschiedliche Zusammensetzung der Membrantransporter auf der luminalen gegenüber der basolateralen Seite einer Enterozyte. Für die Aufrechterhaltung der Ionengradienten sorgt die basolateral sitzende Na-K-ATPase. Der nach innen gerichtete Na+-Gradient ist die Triebkraft für den ebenfalls basolateral lokalisierten Na/2Cl/K- Kotransporter (KNCC1), der für die Sekretion notwendige Cl- Ionen in die Zelle aufnimmt. Abbildung 1.5: Zellmodell der elektrogenen Cl- -Sekretion.
FSK/IBMX erhöht die cAMP-Konzentration, Carbachol (CCh) wirkt hier als Ca2+-Agonist. Beide Signalwege
münden in der Aktivierung der basolateral (bl) sitzenden Kaliumkanäle. Der auswärts gerichtete Kaliumstrom
verstärkt die Hyperpolarisation der Membran und liefert damit die nötige Triebkraft für die luminale (lu) Cl- -
Sekretion durch den CFTR-Kanal. Für die Aufrechterhaltung der Ionengradienten sorgt die Na-K-ATPase.
Die Cl- sezernierenden Enterozyten besitzt in der basolateralen Membran zwei K+-Kanaltypen mit unterschiedlicher Leitfähigkeit. Der eine wird durch Ca2+ aktiviert (Bleich et al. 1996) und der andere (KCNQ1/KCNE3) über die Erhöhung der cAMP-Konzentration (Greger, Bleich, Warth 1997b; Warth et al. 1996). Gut unterscheiden lassen sich die beiden Kaliumkanäle durch die spezifische Hemmung des KCNQ1/KCNE3 Kanals durch das Chromanol 293 B (Bleich et al. 1997; Greger et al. 1997a). Werden Kaliumkanäle aktiviert, führt die Erhöhung des Leitwertes von K+ zu einer Hyperpolarisation der Membran. Erst durch diese Hyperpolarisation entsteht die notwendige Triebkraft für die luminale Cl-- Sekretion durch den CFTR-Kanal (Greger et al. 1996). Das ist deshalb wichtig, da die intrazelluläre Cl-- Konzentration (30 mmol/l) kleiner ist als die extrazelluläre (98-106 mmol/l) und der Cl-- Ausstrom nicht durch den chemischen Gradienten getrieben werden kann. Demnach ist dieser basolateral lokalisierte KCNQ1/KCNE3 Kaliumkanal mitverantwortlich für die Triebkraft, die für den luminalen Chloridausstrom notwendig ist. Seine Inhibition würde zu einem fast vollständigen Ausfall elektrogener Sekretion führen (Bleich et al. 1997; Heitzmann et al. 2008). Dieser KCNQ1/KCNE3 Kanal beschränkt sich nicht nur auf die Kolonkrypten, sondern ist ebenfalls im Dünndarm, in der Trachea und anderen NaCl- sezernierenden Epithelien nachzuweisen (Kunzelmann et al. 2001b). Die Koexpression von KCNQ1 und der ß-Untereinheit KCNE2 wurde in den Parietalzellen der Magenschleimhaut lokalisiert. Hier scheint dieser Kanal an der Säuresekretion beteiligt zu sein (Dedek et al. 2001b; Grahammer et al. 2001; Heitzmann et al. 2004). 1.5.2 Physiologische Bedeutung von neuronalen KCNQ-Kanälen
Die übrigen vier KCNQ-Kanäle (KCNQ2-KCNQ5) sind hauptsächlich im neuronalen Gewebe nachzuweisen, wobei der KCNQ4 Kanal vermehrt in den äußeren Haarsinneszellen des Innenohrs zu finden ist und den K+-Ausstrom über die basale Membran reguliert (Kharkovets et al. 2006; Kubisch et al. 1999). In Neuronen übernehmen diese KCNQ-Kanäle eine wichtige Funktion und werden in Zusammenhang mit dem M-Strom gebracht. Der M- Strom spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung neuronaler Erregbarkeit. Er basiert auf Kalium-Strömen, die bei der Depolarisation langsam aktivieren. Auf diese Weise tragen sie zur Repolarisation bei und verhindern wiederholtes Feuern von Aktionspotenzialen. Zuerst wurde der M-Strom von Brown und Adams in sympathischen Neuronen des Ochsenfrosches beschrieben und später auch im ZNS nachgewiesen (Brown et al. 1980). Im Laufe der weiteren Jahre wurde der M-Strom auch in peripheren Neuronen identifiziert (Marrion 1997a). KCNQ2 und KCNQ3 Kanäle zeigen funktionelle und pharmakologische Charakteristika des neuronalen M-Stroms (Cooper et al. 2000; Wang et al. 1998) und besitzen gleiche Eigenschaften im Schaltverhalten und in der Sensitivität zu den typischen M-Strom Blockern Linopirdin und XE991. Außerdem lassen sich diese Kanäle durch Muscarin inhibieren, wenn der M1-Rezeptor mit koexprimiert wird (Selyanko et al. 2000; Shapiro et al. 2000). Die verwandten KCNQ1, KCNQ4 und KCNQ5 Kanäle werden ebenfalls durch die Stimulation des muskarinergen M1-Rezeptors inhibiert, was eine Beteiligung weiterer Kanäle an der Konstituierung des M-Stroms wahrscheinlich macht, da auch KCNQ4 und KCNQ5 typische kinetische und pharmakologische Eigenschaften dieses Stroms aufzeigen (Lerche et Interessant sind auch die Interaktionsmöglichkeiten dieser KCNQ-Kanäle. Während der KCNQ2-Kanal Homotetramere und auch Heterotetramere mit KCNQ3 bilden kann, zeigt KCNQ3 eine größere Interaktionbreite, in dem diese α-Untereinheiten zusätzlich auch mit KCNQ4 und KCNQ5 assemblieren können (Jentsch 2000; Wickenden et al. 2001). Dabei kann bei einer Koexpression von KCNQ2/KCNQ3, gegenüber der alleinigen Expression von KCNQ2, ein bis zu 10facher Anstieg der Stromamplitude beobachtet werden, was interessanter Weise auf eine erhöhte Anzahl funktioneller Kanäle in der Membran zurückzuführen ist und nicht auf einen Anstieg der Einzelkanalleitfähigkeit oder der Offenwahrscheinlichkeit (Schwake et al. 2000). Die KCNQ2 und KCNQ3 Kanäle werden im ZNS hauptsächlich in Bereichen des Kortex, in den Basalganglien, einschließlich Substantia nigra, im Hippocampus (Biervert et al. 1998; Hansen et al. 2008; Schroeder et al. 1998), sowie in sympathischen Ganglienzellen des Ganglion cervicale superior (Wang et al. 1998) und ebenfalls in peripheren Nerven exprimiert. KCNQ5-Kanäle werden ebenfalls im ZNS exprimiert, wobei sie auch in anderen erregbaren Geweben nachzuweisen sind, darunter viszerale glatte Muskelzellen (Jensen et al. 2005; Jepps et al. 2009) und Skelettmuskelzellen (Lerche et al. 2000). Neuere Studien zeigen erstmals eine Expression von KCNQ5 in glatten Muskellzellen der Gefäßwand (Brueggemann et al. 2007), was auch andere Studien durch eine quantitative Bewertung des mRNA-Spiegels in glatten Muskelzellen verschiedener Gefäßtypen der Maus bestätigen (Yeung et al. 2007). Dabei konnte in der Arteria carotis, femoralis, den mesenterialen Arterien und der Aorta das Vorkommen von KCNQ4 und KCNQ5 am reichhaltigsten nachgewiesen werden. Seitdem wird eine neue wichtige Rolle der KCNQ (Kv7) Kanäle im kardiovaskulären System diskutiert (Mackie et al. 2008). Mittlerweile reichlich belegt ist die Rolle der KCNQ-Kanäle im ZNS. Dabei zeigen Veränderungen des M-Stroms einen hochgradigen Effekt auf die neuronale Erregbarkeit, weil sie als einzige Ströme an der Schwelle von Aktionspotenzialen aktiv sind und ihre langsame Aktivierung und Deaktivierung entscheidend für die Regulation von repetitiven Aktionspotenzialen sind (Rogawski 2000). Eine Inhibition des M-Stroms führt daher zu einer erhöhten neuronalen Erregbarkeit (Jentsch 2000). Dies erklärt, warum Mutationen in neuronalen KCNQ-Kanälen, mit Ausnahme von KCNQ5, zu unkontrollierter neuronaler Aktivität führen können. 1.6 Epilepsie und andere Ionenkanalkrankheiten
KCNQ-Kanäle spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation des Membranpotenzials vieler erregbarer Gewebezellen (Delmas et al. 2005; Robbins 2001). So führen Mutationen in den α- Untereinheiten KCNQ2 und KCNQ3 zur Reduktion des M-Stroms. Bereits eine Verringerung um rund 25% führt zu dem Krankheitsbild der Neonatalen Epilepsie, das die englische Bezeichnung benign familial neonatal convulsions (BFNC) trägt (Biervert et al. 1998; Charlier et al. 1998; Singh et al. 1998). Kurze tonische oder tonisch-klonische Krämpfe, die stereotypisch am 2. oder 3. Lebenstag einsetzen und nach mehreren Wochen spontan remittieren, sind charakteristisch für das BFNC-Syndrom. Etwa 15% der Patienten haben weitere epileptische Anfälle im fortgeschrittenen Alter. Vor einigen Jahren wurde ein weiteres Syndrom beschrieben, bei dem BFNC von später auftretender Myokymie gefolgt wird (Dedek et al. 2001a). Myokymie ist eine Muskelerkrankung, die durch spontane, unwillkürliche Kontraktion von Muskelfasergruppen charakterisiert wird. Im Rahmen dieser Forschung wurde erstmals gezeigt, dass KCNQ2 und KCNQ3 auch im Vorderhorn des Rückenmarks exprimiert werden. 1Barhanin et al. 1996; 2Sanguinetti et al. 1996; 3Neyroud et al. 1997 ; 4Wollnik et al. 1997 ; 5Schroeder et al. 2000b ; 6Dedek & Waldegger, 2001 ; 7Grahammer et al. 2001 ; 8Heitzmann et al. 2004 ; 9Wang et al. 1998 ; 10Singh et al. 1998 ; 11Biervert et al. 1998 ; 14Dedek et al. 2001 ; 15Charlier et al. 1998 ; 16Kubisch et al. 1999 ; 17Kharkovets, 2006 ; 19Lerche et al. 2001 ; 20Schroeder et al. 2000a ; 21Brueggemann et al. 2007 ; 22Yeung et Tabelle 1.2 Expressionsmuster der KCNQ-Gene im Überblick mit den Gen-assoziierten Erkrankungen.
Bisher ist noch keine Erbkrankheit mit KCNQ5 Mutationen in Zusammenhang zu bringen. (1-22 s. Anhang) Epilepsie gehört mit einer Prävalenz von etwa 0,5 % in Deutschland zu den häufigsten Erkrankungen des Zentralnervensystems. Man rechnet jährlich mit 20-25 Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohnern und vermutlich 5 % aller Menschen erleiden einmal im Leben einen epileptischen Gelegenheitsanfall (Poeck 2001). Epileptische Anfälle entstehen durch abnorme elektrische Entladungen zentraler Neurone im Großhirn und dauern, abgesehen vom Status epilepticus, nur einige Sekunden bis Minuten. Dabei kann das Bewusstsein erhalten oder Von den Epilepsien mit genetischer Ursache unterscheidet man die symptomatische Epilepsie, die aufgrund einer Hirnschädigung, so zum Beispiel durch Hirntumore, zerebrale Gefäßmissbildungen oder durch traumatische Hirnverletzung entstehen kann. Unter den idiopathischen Epilepsien finden sich alle Formen, die weder durch Anamnese noch Befund eine organische oder metabolische Hirnkrankheit erkennen lassen. Eine erst kürzlich publizierte Studie (Helbig et al. 2009) bringt das Fehlen kleiner Chromosomenstücke, Mikrodeletion genannt, in Verbindung mit Epilepsie. Diese Studie zeigt, dass bei den untersuchten Epilepsieerkrankten ein Teil des Chromosoms 15 in der Region 15q13.3 fehlt. Nicht nur das Fehlen von Erbinformation kann die Körperfunktionen schwerwiegend beeinflussen, auch die Veränderungen der Erbinformationen können Verlust oder auch Zugewinn von Funktionen bedeuten. Ein rezessiver Erbgang ist häufig mit Mutationen verbunden, die zum Funktionsverlust und einer ausgeprägteren Symptomatik führen. Einige Mutationen führen aber auch zu einem dominant-negativen Effekt, der bei heterozygoten Individuen zu einer Reduktion der Funktion von über 50% der Ausgangswerte führt (Hubner et al. 2002). Das erste ausführliche Beschreiben des Long-QT-Syndroms erfolgte 1957 und geht auf Jervell und Lange-Nielsen zurück. Sie beschrieben eine achtköpfige norwegische Familie, in der vier Kinder taubstumm waren. Auffallend in dieser Familie waren die wiederholten Schwindelanfälle und Bewusstlosigkeiten, zusammen mit einem verlängerten QT-Intervall im EKG. Drei dieser Kinder verstarben an einem plötzlichen Herztod. Erst später wurde ein autosomal-rezessiv vererbtes Syndrom mit Innenohrschwerhörigkeit und QT-Verlängerung als Ursache identifiziert, welches heute unter dem Namen Jervell und Lange-Nielsen- Syndrom bekannt ist (Neyroud et al. 1997; Wollnik et al. 1997). Bei etwa 70% der kongenitalen Long-QT-Syndrome liegt eine der autosomal-dominanten Varianten ohne Hörstörung vor, die auf eine dominant-negative Mutation sowohl in KCNQ1 als auch KCNE1 zurückzuführen ist und als Romano-Ward-Syndrom bezeichnet wird (Barhanin et al. 1996; Sanguinetti et al. 1996). Auch hier zeigt sich der Einfluss des Erbganges auf das Ausmaß der Erkrankung, da bei Mutationen mit dominantem Erbgang noch eine Kanalrestfunktion vorliegt (Hubner, Jentsch 2002). Eine weitere Kardiomyopathie ist das Brugada-Syndrom. Als eigenständige Erkrankung wurde es erst in den 90er Jahren des 20. Jahrhunderts identifiziert und den Ionenkanalkrankheiten zugeordnet. Es handelt sich um eine recht seltene, meist autosomal- dominant vererbte Erkrankung des Herzens, die im Jugend- und frühen Erwachsenenalter zum plötzlichen Tod führen kann, obwohl die Patienten scheinbar völlig herzgesund sind. Die dem Syndrom zu Grunde liegende Repolarisationsstörung der Herzmuskelzellen ist nicht spürbar, lediglich im EKG können typische Veränderungen auftreten, die aber auch wechselnd ausgeprägt, oder nur zeitweise vorhanden sein können. Daher kann auch die genaue Identifikation der betroffenen Mutationen von großer Bedeutung sein, um diese Erkrankung rechtzeitig zu erkennen und behandeln zu können. Bisher konnte nur bei einem kleinen Teil der Patienten (15-25%) eine Mutation des Gens SCN5A, das auf dem dritten Chromosom kodiert ist, identifiziert werden. Dieses Gen trägt Informationen für einen spannungsabhängigen Natrium Kanal, das im Falle einer Mutation zu Herzrhythmusstörungen mehrerer Syndrome führen kann (Moric et al. 2003). Eine neuere Studie (Delpon et al. 2008) bringt eine Mutation in der ß-Untereinheit KCNE3 in Zusammenhang mit dem Brugada- Syndrom und zeigt durch Koimmunpräzipitationsstudien, dass KCNE3 in Koexpression mit einem kardialen Kaliumkanal Kv4.3 im linken Vorhof des menschlichen Herzens nachzuweisen ist. 1.7 Das Antiepileptikum Carbamazepin
Die Behandlung von Epilepsie ist auf Grund ihrer vielseitigen Ätiologie sehr komplex. Die Therapieziele werden in erster Linie durch eine geeignete Pharmakotherapie erreicht, wobei der Wirkstoff Carbamazepin und das strukturähnliche Oxcarbazepin immer noch eine Hauptrolle unter den therapeutischen Möglichkeiten spielen. Seit den 50er Jahren des letzten Jahrhunderts findet der Wirkstoff Carbamazepin als Antikonvulsivum Anwendung und wird speziell zur Behandlung fokaler und sekundär generalisierter Anfälle eingesetzt (Engel, Jr. et al. 1982; Gado-Escueta et al. 1983). Carbamazepin wird außerdem auch zur Behandlung von Trigeminus-Neuralgien (Taylor et al. 1981), akuten Manien (Ballenger et al. 1980), Verhaltensstörungen (Lenzi et al. 1986), oder zur Prophylaxe bipolarer affektiver Störungen (Placidi et al. 1986) eingesetzt. Darüber hinaus findet es Anwendung als Präventionsschutz vor Krampfanfällen im Benzodiazepin- und Alkoholentzug, weil die Einnahme von Carbamazepin die Krampfschwelle des ZNS anzuheben scheint (Barrons et al. 2010). Der Wirkungsmechanismus von Carbamazepin beruht hauptsächlich auf einer reversiblen Bindung an spannungsgesteuerte Na+-Kanäle, wobei repetitive neuronale Entladungen gehemmt werden (McLean et al. 1986; Willow et al. 1984). Diese Hemmung scheint spannungsselektiv und dosisabhängig zu sein (Courtney et al. 1983; Willow, Kuenzel, Catterall 1984). Bei der Behandlung von Neuralgien beruht die schmerzlindernde Eigenschaft vermutlich auf der Hemmung der Reizweiterleitung der betroffenen Nerven im Rückenmark, beziehungsweise in den Kopfganglien. Des Weiteren hat Carbamazepin einen antidiuretischen Effekt (Braunhofer et al. 1966), der bei Diabetes insipidus centralis zu einer Verminderung der Harnmenge und des Durstgefühls Carbamazepin gehört in die Klasse der trizyklischen Aromaten, wie die Abbildung 1.6 zeigt. Carbamazepin Carbamazepin-10, 11-Epoxid
Abbildung 1.6: Struktur von Carbamazepin und seines aktiven Metaboliten Carbamazepin-10,11-Epoxid.
Die Resorption von Carbamazepin ist relativ langsam (2-8 Stunden), die Halbwertszeit im Plasma beträgt ca. 36h nach einer Einzelgabe, wobei man bei medikamentös eingestellten Patienten eine deutliche Abnahme der Halbwertszeit feststellt. Das liegt wahrscheinlich daran, dass das Carbamazepin als ein Induktor wirkt und in der Leber die Enzymaktivität seines abbauenden Enzyms selbst steigern kann (Cascorbi 2003). Es wird über das Cytochrom-P450- Enzymsystem verarbeitet und eins seiner Folgeprodukte ist das Carbamazepin-10,11-Epoxid (EPX), das ebenfalls antiepileptische Eigenschaften besitzt. Die Therapie mit Carbamazepin sollte einschleichend, mit einer niedrigen Initialdosis begonnen werden. Die Festlegung der therapeutischen Dosis erfolgt über den Plasmaspiegel und in Abhängigkeit von der Wirksamkeit, wobei der allgemeine Tagesdosisbereich zwischen 400mg und 1200mg liegt und der Plasmaspiegel 4-12µg/ml (17-50µmol/l) betragen sollte. Eine Überschreitung des Plasmaspiegels über 20µg/ml hat eine Verschlechterung der Krankheitsbilder zur Folge. Die Plasmaproteinbindung beträgt 70-80% und unterliegt kaum Schwankungen, da der Anteil der ungebundenen Anteile bis zu einer Konzentration von 50µg/ml konstant bleibt. Der Metabolit EPX ist dagegen zu 48-53% an Plasmaproteine gebunden. Die Liquorkonzentration beträgt 33% der jeweiligen Plasmakonzentration. Zahlreiche Nebenwirkungen sind im Zusammenhang mit der Einnahme von CBZ bekannt (Möller, 2005). Gerade bei der Einleitung der Therapie oder einer Überdosierung werden Beeinträchtigungen des ZNS, wie Schwindel, Ataxie oder Erbrechen beobachtet. Häufig werden auch verminderte Plasmaosmolarität, Hyponatriämie und Ödeme beschrieben. 1.8 Fragestellung
Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit beruht auf Befunden, die in ex-vivo Versuchen an Epithelien gemacht wurden. Auf der Suche nach einer möglichen Erklärung der Entstehungsursache einer Carbamazepin induzierten Hyponatriämie wurden Ussing-Kammer Untersuchungen an isolierten Kolonkrypten durchgeführt. Dabei konnte beobachtet werden, dass Carbamazepin (CBZ) auch direkt auf Epithelien wirkte. Es führte zu einer dosisabhängigen Inhibition der luminalen, cAMP-abhängigen Chloridsekretion, deren halbmaximale Wirkkonzentration IC50 sich im therapeutisch wirksamen Bereich befand (Sievers, 2008). Für die Triebkraft, die für den Chloridausstrom nötig ist, wird der KCNQ1/KCNE3 Kaliumkanal mitverantwortlich gemacht (Bleich et al. 1996; Greger et al.1997a; Warth et al. 1996). Hieraus entstand die Hypothese, dass KCNQ1/KCNE3 durch CBZ gehemmt werden könnte. In diesem Falle wäre es dann wiederum naheliegend, eine Wirkung auf weitere Vertreter der KCNQ Familie zu überprüfen, da das Antikonvulsivum CBZ seine Hauptwirkung auf spannungsgesteuerte Natriumkanäle entfaltet (Willow et al. 1984), die in Neuronen, besonders am Axonhügel mit einer großen Dichte spannungsgesteuerter KCNQ-Kanäle kolokalisiert sind (Maljevic et al. 2008). Zentrale Fragestellungen dieser Arbeit sind: 1) Welche Wirkung zeigt CBZ auf epitheliale KCNQ1/KCNE3 Kanäle und möglicherweise
auch auf KCNQ1/KCNE1 Kanäle? 2) Sind neuronale KCNQ Kanäle in die antikonvulsive Wirkung von CBZ involviert?
3) Welchen Einfluss zeigt der pharmakologisch aktive Metabolit Carbamazepin-10,11-Epoxid
(EPX) auf KCNQ-Kanäle? 2 Materialien und Methoden
2.1 Chemikalien und Enzyme
Es wurden, soweit nicht anders angegeben, Standardchemikalien der Firma Carl Roth (Karlsruhe, D) verwendet, die ausschließlich in den Qualitätsstufen reinst oder p.a. zur Anwendung kamen. Die Restriktionsendonukleasen und andere DNA-modifizierende Enzyme stammten von Fermentas GmbH (St. Leon-Rot, D). Die zur Entfernung der follikulären Zellen verwendete Kollagenase A und das Narkotikum Tricain stammen von der Firma SIGMA. Das Carbamazepin (Tegretal®) und sein Metabolit Carbamazepin-10,11- Epoxid wurden von der Firma Novartis zur Verfügung gestellt. 2.2 Puffer, Lösungen und Bakteriennährmedien
Collagenase-Lösung 100mM NaCl, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 5mM HEPES, 2mg/ml Kollagenase A, pH 7,4; anschließend steril filtrieren DEPC-H2O 0,1 % DEPC, 12h bei 37 °C inkubiert, anschließend autoklaviert DNA-Auftragspuffer 30% (v/v) Glycerin; 50mM EDTA; 0,001 %(w/v) Xylencyanol; 0,001 % (w/v) Bromphenolblau ND96-Lösung 96mM NaCl, 2mM KCl, 1,8mM CaCl2, 1mM MgCl2, 5mM HEPES, pH 7,4, autoklaviert 20x TAE-Puffer 0,8M Tris, 0,2M NaAcetat, 20mM NaEDTA, pH 7,8 Luria-Bertani-Medium (LB) 10g Bactotrypton, 5g Hefeextrakt, 10g NaCl Ad 1000ml dH2O, pH 7,0 LB+Amp-Medium LB-Medium + 50mg/l Ampicillin
LB+Amp/Agar LB+Amp-Medium + 15g/l Bacto-Agar
LB/ Agar LB-Medium + 18 g/l Bacto-Agar
LB+Tetrazyklin-Medium 50ml LB-Medium + 20mg/l Tetrazyklin

2.3 Plasmid
Zur Herstellung der cRNA für die Mikroinjektion in Xenopus laevis Oozyten wurde der
pTLN Vektor verwendet. Hierbei handelt es sich um eine Modifikation des pSP64T Vektors, der zur Expressionssteigerung die 5 - und 3 - untranslatierten Regionen des Xenopus ß- Globulins enthält. Um die Linearisierung des Vektors zu erleichtern wurden für die Abwandlung mehrere zusätzliche Restriktionsstellen hinter die kodierten Bereiche eingefügt (Lorenz et al. 1996). Für die Transkription der Gene besitzt dieser Vektor unter anderem einen SP6-RNA-Promotor. Zur Vermehrung der Plasmidvektoren in Escherichia Coli -Bakterien wurde der Stamm XL- 1-blue verwendet.
2.4 Mikrobiologische Methoden
2.4.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen
Zur Kultivierung der bei -80 °C gelagerten Glycerin-Dauerkultur von XL-1-Blue Bakterien wurde ein Teil sequentiell auf eine LB-Agarplatte (+Tetracyclin) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C gelagert. Eine der Einzelkolonien wurde zum Animpfen einer 50ml LB+Tetracyclin-Vorkultur (20mg/l Tetracyclin) verwendet und anschließend bei 37 °C über Nacht inkubiert. Von dieser Vorkultur wurden 20ml für eine weitere Anzucht von einer 1 l- LB-Medium-Kultur verwendet und bis zum Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase mit einer optischen Dichte von 0,5-0,6 bei 37°C kultiviert. Nach dem Sedimentieren (15min., 5000Upm, 4 °C, Beckman J2-HS Zentrifuge) wurde der Überstand verworfen und das Bakterienpellet in 100ml autoklaviertem und auf 4 °C vorgekühltem dH2O resuspendiert, um anschließend wieder zentrifugiert zu werden. Diese Waschung erfolgte ein zweites Mal. Um die bevorstehende DNA-Aufnahme der Zellen zu begünstigen wurde das Pellet in 40ml zehnprozentiger Glycerinlösung aufgenommen und in 50ml Röhrchen überführt. Nach einem erneuten 20minütigen Zentrifugieren bei 3200Upm und 4 °C wurde der Überstand verworfen und das Pellet in 4ml zehnprozentigen Glycerinlösung gelöst, anschließend wurde es in 50µl Aliquots auf Trockeneis schockgefroren. Bis zur weiteren Verwendung erfolgt die Lagerung 2.4.2 Transformation von Bakterien durch Elektroporation
Als Transformation wird die Aufnahme von DNA-Molekülen in kompetente Bakterienzellen bezeichnet. Die gerichtete Aufnahme ausgewählter Plasmid-DNA durch verwendete E.coli Stämme XL-1Blue erfolgte durch Elektroporation mit einem Genepulser (BioRad, Deutschland). Dazu wurden 1µl eines Ligationsansatzes mit 50µl frisch aufgetauten Bakteriensuspension in einer vorgekühlten Elektroporationsküvette (PeqLab, Erlangen, D) vereinigt und anschließend mit einem Spannungsimpuls von 2,5kV geschockt. Zur Erholung wurden die transformierten Zellen in 1ml LB-Medium aufgenommen und für 30-60Minuten bei 37°C inkubiert. Daraufhin erfolgte ein Zentrifugationsschritt bei 6.000Upm für zwei Minuten. Der Überstand wurde bis auf 100µl verworfen und das Pellet im verbliebenen Medium resuspendiert, bevor es mit Hilfe eines Drigalski-Spatels auf LB-Amp/ Agar-Platten (50mg/l Ampicillin) ausplattiert wurde. Nach 14-20 stündiger Inkubation bei 37°C wurde die DNA mittels Mini- oder Midipräparation aus den Bakterien isoliert. 2.4.3 Präparation von Plasmid- DNA
Mittels alkalischer Lyse wurde die Plasmid DNA aus den Bakterienzellen isoliert. Kleinere Mengen DNA konnten aus 3ml-Kulturen durch eine Minipräparation gewonnen werden. Dazu wurde das E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit 1 (PeqLab, Erlangen, D) gamäß der Gebrauchsanleitung verwendet. Um größere Mengen an DNA isolieren zu können, wurden 100ml Bakteriensuspensionen strikt nach dem Protokoll des Jetstar Plasmid Purification MIDI Kits (Genomed, Löhne, D) behandelt. Anschließend wurde die präparierte Plasmid-DNA in 50-100µl dH2O aufgenommen und mit einem DNA-Photometer quantifiziert. 2.4.4 Konzentrationsbestimmung durch Extinktionsmessung
Zur Bestimmung der DNA-Konzentration wurde das Gene Qaunt Pro Photometer (Cambridge, GB) verwendet. Das Kalibrieren des Photometers erfolgte durch Bestimmung des Nullwertes für das verwendete Lösungsmittel (dH2O). Die einzelnen Proben wurden dann in 100µl Quarzküvetten bei Wellenlängen von 230nm, 260nm und 280nm gemessen. DNA- Moleküle haben ein Absorptionsmaximum bei 260nm, daher ergab sich bei dieser Wellenlänge für eine optische Dichte von 1 die Konzentration von 50µg/ml an doppelsträngiger DNA. Die relativen Werte der anderen beiden Wellenlängen zeigen den Grad der Verunreinigung zum Beispiel durch Salze und wurden vom relativen Wert für die DNA-Moleküle subtrahiert. 2.5 Molekularbiologische Methoden
Um eine ausreichende Menge an gewünschter DNA zur Verfügung zu haben, musste diese vermehrt werden. Hierfür werden DNA-Vektoren eingesetzt, die am häufigsten als Plasmide verwendet werden. Plasmide (Kap.2.3) sind kleine ringförmige DNA-Moleküle, die mit anderen DNA-Fragmenten kombiniert werden können, um anschließend in Bakterien vervielfältigt zu werden, ohne sich in das bakterielle Genom zu integrieren. Zunächst wird die vorhandene DNA mit einem Restriktionsenzym geschnitten, genau wie das Plasmid (Kap.2.5.1). Beide Fragmente werden ligiert (Kap.2.5.2), in Bakterien eingebracht (Kap.2.4.1 und 2.4.2) und anschließend kultiviert. Nachdem das Plasmid in den Bakterien repliziert wurde, erfolgt eine Isolierung, Aufreinigung (Kap.2.4.3) und Konzentrationsbestimmung (Kap.2.4.4). Damit der gewünschte Informationsträger in Form von cRNA in die Oozyte injiziert werden kann, muss die DNA zuvor in cRNA transkribiert werden (Kap.2.5.3) 2.5.1 Restriktionsverdau
Dieser Vorgang beschreibt die Behandlung der DNA mit Restriktionsenzymen, die in der Lage sind spezifische Sequenzen zu erkennen und an benötigten Stellen die Phosphodiesterbrücken zu spalten. Mit Hilfe von geeigneten Puffersystemen und einer Restriktionsendonuklease der Firma Fermentas (St. Leon-Rot, D) wurden insgesamt 2µg Plasmid DNA zum Restriktionsverdau angesetzt und bei 37°C für mindestens zwei Stunden inkubiert. Dabei wurde je nach Verwendung und Verträglichkeit der Restriktionsenzyme ein Doppelverdau angesetzt oder die Ansätze wurden nacheinander verdaut. Um eine Selbstligation der gerade linearisierten Plasmid DNA Moleküle zu verhindern, wurde den Reaktionsansätzen 1 Unit/µl alkalische Phosphatase (CIAP; Fermentas GmbH, St. Lorenz-Rot; D) hinzugefügt und für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Damit wurde das 5 -Ende der Plasmid DNA dephosphoryliert. Anschließend wurde die Probe elektrophoretisch aufgetrennt, um zu erkennen, ob die DNA vollständig geschnitten wurde. 2.5.2 Ligation von DNA Fragmenten
Als Ligation wird die Vereinigung zweier DNA-Moleküle bezeichnet. Die dabei benötigte DNA-Ligase katalysiert die Bildung neuer Phosphodiesterbrücken. Auf diese Weise können die komplementären einzelsträngigen Enden eine Basenpaaarung eingehen. Dazu wurden die geschnittenen linearisierten DNA-Fragmente mit dem dephosphorylierten Vektor im Verhältnis 7:1 gemischt und mit dem T4-Ligase-Puffer sowie 1U der T4-DNA- Ligase (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, D) versetzt. Er folgte eine über Nacht Inkubation bei 17°C, mit dem Ziel der Synthese von doppelsträngiger, ringförmig geschlossener Plasmid DNA, die das gewünschte Insert beinhaltet. Um die T4-DNA-Ligase zu inaktivieren wurde der Reaktionsansatz kurzzeitig mit Hitze behandelt (10 min; 65 °C) und konnte anschließend für die Transformation verwendet werden. Als Kontrolle diente der gleiche Reaktionsansatz mit Ausnahme von linearisierten DNA- Fragmenten, da der dephosphorylierte Vektor selbst in Anwesenheit einer DNA-Ligase nicht wieder religieren kann und als Kontrolle nach der Transformation keine Klone aufweist. 2.5.3 In-vitro-Transkription von DNA in cRNA
Um die Injektion von Xenopus leavis Oozyten durchführen zu können, mußte die plasmidkodierte cDNA in komplementäre cRNA umgeschrieben werden. Zunächst wurden 4µg Plasmid-DNA mit der Restriktionsendonuklease HpaI linearisiert, in dem sich die Schnittstelle in 3 -Richtung hinter der Polyadenylierungssequenz im Plasmidvektor pTLN befand. Es folgte eine Aufreinigung des linearisierten Plasmids mit High Pure PCR Product Purifikation Kit (Roche, Mannheim), mit anschließender Aufnahme in 50µl DEPC-H2O. Um die emfindliche RNA nicht zu zerstören, wurde unter RNase-freien Bedingungen gearbeitet. Die cRNA-Synthese erfolgte mit dem mMessage mMachine Kit (Ambion, Austin, Texas) unter Verwendung der SP6-Polymerase gemäß der Anleitung. Dazu wurden 3µl linearisierte DNA, 5µl NTP-Mischung, 1µl 10x Reaktionspuffer und 1µl SP6-Enzym Mix vermischt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurde die RNA mit 12,5µl LiCl und 15µl DEPC-H2O für mindestens 30 min bei -20°C gefällt und durch Zentrifugation (20min, 14000U/min, Kühlzentrifuge, 4°C) pelletiert. Es folgte eine Waschung mit 250µl 70% Ethanol. Danach wurde erneut für 10min pelletiert und anschließend im Schüttler bei 37°C luftgetrocknet, damit das Ethanol entweichen konnte. Gleich im Anschluß daran wurde die RNA im 13µl RNase- freien DEPC-H2O resuspendiert. Zur Konzentrationsbestimmung mit dem Photometer und zur elektophoretischen Auftrennung wurden jeweils 1µl dieser Resuspension verwendet. Nach einer erfolgreichen Synthese und Qualitätskontrolle wurde die cRNA bei -20°C eingefroren oder gleich in Xenopus laevis Oozyten injiziert. 2.5.4 Agarosegelelektrophorese
Die Nukleinsäuren haben aufgrund der negativen Nettoladung der Phosphatgruppen die Fähigkeit im elektrischen Feld zur Anode zu wandern, wobei die Wanderungsgeschwindigkeit von der Größe der Moleküle abhängig ist. Zur Analyse von DNA-Fragmenten durch elektophoretische Auftrennung wurden Agarosegele (1% bis 1,5% Agarose in TAE) verwendet. Zur Anfärbung der DNA wurde den Gelen Ethidiumbromid zugesetzt. Vor dem Auftragen der Proben wurde die DNA mit 1/10 Volumen DNA-Auftragspuffer versetzt. Die anschließende Auftrennung erfolgte in TEA- Puffer für 30min bei einer Spannung von 140 V (Spannungsguelle PowerPac 300, Biorad, Hercules, USA). Die Größe der Fragmente wurde mit einem Größenstandard, dem 1 kb - Marker von Invitrogen (Karlsruhe, D) verglichen. Nach dem Auftrennen wurden die Proben auf einem UV-Transilluminator (Reprostar, Camag, Mattenz, CH) analysiert und gegebenenfalls mit einem Skalpell aus den Gelen herausgeschnitten. Mit Hilfe des High Pure PCR Product Purification Kits (Roche, Mannheim, D) konnten die DNA- Fragmente aus der Gelmatrix isoliert und aufgereinigt werden. Um eine Degradation der cRNA ausschließen zu können, wurde die Gelelekrophorese zur Integritätskontrolle verwendet. Dazu wurde 1µl cRNA mit dem Auftragspuffer aus dem SP6 mMessage mMachine Kit (Ambion, Austin, TX, USA) versetzt und anschließend auf ein nicht-denaturierendes Agarosegel aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte bei 140V und zur Visualisierung wurde auch hier Ethidiumbromid verwendet. 2.6 Elektrophysiologische Methoden
Die elektrophysiologischen Untersuchungen dieser Arbeit wurden an Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis (Abb. 2.1) durchgeführt. Aufgrund der niedrigen Dichte endogener Kaliumkanäle und der einfachen Handhabung, bedingt durch die Größe der Zellen, wurden die Xenopus Oozyten als Expressionssystem ausgewählt. Es stellt ein etabliertes System dar, das die Messung von Ionenkanälen erlaubt (Stuhmer 1992). Zu diesem Zweck wurde die cRNA von ausgewählten Kaliumkanälen in Oozyten injiziert und die Wirkung der inkubierten Substanzen mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme 2.6.1 Oozytenpräparation
Für die Entnahme der Oozyten eignen sich ausgewachsene weibliche Xenopus laevis Frösche, die in einer 0,25% Tricain-Lösung narkotisiert wurden. Das Froschweibchen wurde direkt aus dem Hälterungsbecken in eine Plastikwanne gesetzt, die mit der auf 4 °C gekühlten Narkoselösung gefüllt war. Das Herausspringen des Frosches verhinderte ein Wannendeckel. Nach etwa 10 bis 15 Minuten wurde die gewünschte Narkosetiefe erreicht. Als Kontolle diente die reaktionslose Rückenlage des Frosches. Das über die Haut aufgenommene Narkotikum wurde nach der Oozytenpräparation wieder auf dem gleichen Wege mit Leitungswasser ausgewaschen. Um den Stoffwechsel des Versuchstieres auf ein Minimum zu reduzieren und somit die Narkosetiefe möglichst konstant zu halten wurde der Frosch auf eine eisgekühlte Operationsunterlage gelegt. Um das Austrocknen der übrigen Körperteile zu verhindern wurde das Operationsfeld mit feuchten Zellstofftüchern eingegrenzt. Die erste Schnittführung erfolgte am Unterbauch, in Verlängerung zum Oberschenkel, mit einer Schnittlänge von 10-15mm und durchtrennte die Bauchhaut. Mit einem zweiten Schnitt in gleicher Richtung wurde die Muskelfaszie und die Muskelschicht durchgetrennt sowie das Peritoneum eröffnet. Der geschaffene Zugang zum Bauchraum gewährte Einblick auf das Mesovar. Nach der Begutachtung des Ovarialsäckchens erfolgte die Entnahme durch einen feinen Scherenschnitt, der die gewünschte Oozytenmenge von der in situ verbleibenden separierte. Anschließend wurde das Oozytensäckchen in eine sterile Petrischale mit Kollagenaselösung gelegt und mit feinen Pinzetten portioniert. Um die Operationswunde zu versorgen, wurden drei bis vier Knopfnähte gesetzt, wobei die Muskelschicht mit der Faszie zuerst vernäht werden musste. Anschließend erfolgte die Wiederherstellung einer intakten Hautoberfläche. Als Nahtmaterial wurde ein resorbierbares Polyglactin (Ethicon, Vicryl rapid, Polyglactin geflochten, resorbierbar, steril) verwendet. Nach der Wundkontrolle wurde das Tier in ein Aufwachbecken mit Leitungswasser gelegt, das auf der einen Seite das Einfließen des Wassers und auf der anderen Seite einen Abfluss ermöglichte, um die Aufwachphase des Tieres zu beschleunigen. Dabei musste beachtete werden, dass sich die Atmungslöcher des Frosches über der Wasseroberfläche befanden, der Körper aber ausreichend feucht gehalten wurde. Nachdem sichergestellt wurde, dass das Tier aufgewacht war, erfolgte das Umsetzen für 24 Stunden in ein separates Becken, bevor es zu seinen Artgenossen zurückgesetzt werden Eine erneute Oozytenpräparation des gleichen Tieres war in Abständen von sechs bis acht Wochen möglich. 2.6.2 Vorbereitung und Selektion der Oozyten
Nach einer zwei- bis dreistündigen Inkubation des Oozytensäckchens in Ca2+-freier Kollagenaselösung bei Raumtemperatur und unter leicht schüttelnden Bedingungen waren die Oozyten frei von Blutgefäßen, Follikelzellen und Bindegewebe. Durch das mehrmalige Waschen mit ND96-Lösung wurden die Oozyten für die Selektion vorbereitet und die Kollagenase deaktiviert. Für die elektrophysiologischen Untersuchungen eignen sich Oozyten der Reifephasen V und VI, die aufgrund ihrer Größe (V 0,6-1mm und VI 1-1,2mm) und scharfen Abgrenzung der beiden Pole leicht von den früheren Phasen zu unterscheiden waren. Nach der Selektion mit Hilfe einfacher Plastik-Einmalpipetten (Sarstedt, Nümbrecht,D) unter einem Binokularmikroskop wurden die Oozyten bis zur Injektion der cRNA für mehrere Stunden oder über Nacht in einem Inkubator (Binder, D) bei konstant 17° C gelagert. 2.6.3 Mikroinjektion von cRNA
Für die Injektion der cRNA in die Xenopus laevis Oozyten wurden Glaspipetten (Drummond scientific, USA) mit Hilfe eines Horizontal-Pipettenziehgerätes (DMZ-Universal-Puller; Zeitz-Instrumente, Augsburg) gezogen, mit Mineralöl DC200 (Sigma-Aldrich) gefüllt und in ein WPI Nanoliter 2000 Mikropipetten-Injektionsgerät (World Precision Instruments, Sarasota, USA) eingespannt. Die zuvor hergestellte cRNA wurde auf das benötigte Mischungsverhältnis gebracht, bevor sie injiziert werden konnte. Die Gesamtmenge der cRNA setzte sich bei Co-Injektionsexperimenten im Verhältnis 1:1 aus den einzelnen cRNAs zusammen, wobei die cRNA der KCNE1 und KCNE3 Untereinheiten zunächst auf 1:10 verdünnt wurde. Die eisgekühlte cRNA wurde vor dem Aufziehen mit der Mikropipette auf einen gespannten Parafilm pipettiert und somit verhindert, dass die Pipettenspitze bei der Aufnahme abbrach. Unter einem Binokularmikroskop (Zeiss, Deutschland) erfolgte die Injektion von 50nl pro Oozyte (Konzentration 0,5µg/µl) mit Mikropipetten mit einer Öffnung von 5-10µm Durchmesser. Die Spitze der Pipette wurde zuvor mit einem sterilen Instrument angeschrägt und besaß die Form einer Kanüle. Durch diese Maßnahme wurde das Einstechen erleichtert und die Beschädigung der Zellen bei der Injektion möglichst gering gehalten. Die anschließende Aufbewahrung der Oozyten erfolgte in ND96-Lösung separiert auf sterilen 96 Loch-Platten (Sarstedt, Nümbrecht, D) im Inkubator bei 17°C. Als Kontrolle dienten Zellen, die lediglich mit dem RNA-Lösungsmittel (DEPC-H2O) injiziert wurden. 2.6.4 Die Methode der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme
Drei bis vier Tage nach der cRNA-Injektion wurden die Xenopus Oozyten mit Hilfe der Zwei- Elektroden-Spannungsklemm-Methode elektrophysiologisch untersucht. Dieses Verfahren erlaubt die Messung des Stromflusses durch die Kanäle in der Oozytenmembran in Abhängigkeit vom Membranpotenzial. Die sich dabei verändernden Ströme konnten unter Verwendung eines Turbo Tec 05x Verstärkers (npi electronic GmbH, Tamm, D) registriert und mit Hilfe des Digidata 1322A Umwandlers (Axon Instruments, USA) in digitale Signale konvertiert werden. Unter Anwendung der Software pCLAMP 9.2 wurden die Pulsprotokolle gesteuert, an einen PC geleitet und ausgewertet. Diese Messtechnik, die auf Cole und Curtis zurückgeht und auf den Untersuchungen von Hodgkin und Huxley am Axon des Tintenfisches basiert, wurde nach Stühmer (Stuhmer et al. 1992) modifiziert und angewendet. Zu diesem Zweck wurden Messelektroden aus Borosilikatglas-Filamentkapillaren (Clark Electromedical Instruments, Reading, GB) mit Hilfe das Horizontal-Pipettenziehgerätes (DMZ-Universal-Puller; Zeitz-Instrumente, Augsburg) hergestellt und anschließend luftblasenfrei mit 2M KCl-Lösung befüllt. Durch das Aufschieben dieser Kapillare auf den Elektrodenhalter, der zentral einen chlorierten Silberdraht enthielt, wurden die Spannnungs- und Stromelektroden für das Experiment vorbereitet. Vor jeder Messung erfolgte eine Widerstandsmessung der einzelnen Elektroden, die nur dann verwendet wurden, wenn die Widerstände im Bereich von 0,5-1,5 MΩ lagen. Die Referenzelektroden wurden in Kammern mit 2M KCl-Lösung verschraubt und standen über Agarbrücken (1% Agarose) in Verbindung mit der Messkammer. Die in einer Vertiefung der Messkammer liegende Oozyte wurde über ein Schwerkraft-getriebenes Perfusionssystem ständig mit frischer ND96-Lösung umspült und durch eine am Kammerabfluss angeschlossene Saugpumpe wurde für ein gleichbleibendes Lösungsvolumen gesorgt. Auf diese Weise konnten die unterschiedlichen Konzentrationen der Wirksubstanzen mit dazwischen liegenden Auswaschphasen eingesetzt werden. Abbildung 2.2: Schematische Darstellung eines Zwei-Elektroden-Spannungsklemmmsystems. Die Strom-
(I) und die Spannungselektrode (V) sind in eine Xenopus Oozyte hineingestochen, die sich in einer
Kontrolllösung befindet. Durch Anlegen von Kommandopulsen kann der Stromfluss in Abhängigkeit von der
Änderung des Membranpotenzials gemessen werden. Der induzierte Strom spiegelt dabei den Gesamtstrom
durch alle zu eine definierten Zeitpunkt geöffneten Ionenkanäle zuzüglich des Betrages anderer elektrogener
Transportprozesse wider.
Unter einem Binokular (Zeiss, Jena, D) wurden die Potenzial- und Stromelektrode mittels Mikromanipulatoren vorsichtig in die Oozyte hineingestochen. Die aktuelle Potenzialdifferenz zwischen dem Inneren der Oozyte und der Badlösung, deren Potenzial definitionsgemäß null Volt beträgt, konnte durch die Spannungselektrode gemessen werden. Mit Hilfe der Stromelektrode konnte der Oozyte ein, vom Ruhezustand abweichendes Membranpotenzial aufgezwungen werden. Zu unterscheiden sind grundsätzlich zwei Messmethoden. Der voltage clamp (Spannungsklemme) und der current clamp Modus (Stromklemme). Beim voltage clamp Modus wird ein Potenzial, das als Klemmspannung bezeichnet wird, durch das Anlegen eines Injektionsstromes über die Stromelektrode auf einen festen Wert eingestellt und konstant gehalten. Weicht das über die Spannungselektrode gemessene tatsächliche Membranpotenzial von dem eingestellten Klemmpotenzial ab, so wird das über eine Messeinrichtung registriert und durch die Veränderung des Injektionsstromes dem eingestellten Sollwert angeglichen. Der Injektionsstrom entspricht dem Gesamtfluss an geladenen Teilchen durch alle Ionenkanäle und elektrogenen Transportprozesse in der Oozytenmembran. Im Gegensatz zur Spannungsklemme wird im current clamp Modus der Strom konstant gehalten, während das Potenzial als variable Größe erfasst wird. Das Membranpotenzial entspricht dem Wert bei der Stromstärke null. Bei beiden Messmethoden ist die Berechnung des Widerstandes über das Ohm sche Gesetz Abbildung 2.3: Ohm sches Gesetz. R steht für Widerstand [in Ohm], U für das Membranpotenzial [in Volt]
und I für den Strom [in Ampere].
Das Ohm sche Gesetz beschreibt die Beziehung zwischen dem Membranpotenzial und der
Größe des Membranstromes. Der Leitwert der Zellmembran (G) kann dabei aus der Steigung der Strom/Spannungskurve ermittelt werden und verhält sich ungekehrt proportional zum Um den Stromfluss über die Membran messen zu können, musste zunächst ein geeignetes Versuchsprotokoll gewählt werden. Die Oozyte wurde, ausgehend von einem Haltepotenzial von -80 mV in jeweils 10 mV Schritten von -90mV bis +40 mV geklemmt. Die jeweiligen Klemmschritte wurden 500ms lang gehalten, anschließend folgte eine 200ms lange Klemmperiode bei -30mV (Abb. 2.4 C). Zwischen zwei Klemmprotokollen war eine Pause von 30s bei einem Haltepotenzial von -80mV. Abweichende Protokolle sind jeweils Wenn also ein bestimmtes Kanalprotein stark exprimiert wird, so repräsentiert der Stromfluss über die Membran nahezu ausschließlich den Stromfluss durch diesen Kanal. Das wird auch deutlich beim Vergleich der Ableitungsbeispiele Abb. 2.4 A und B. Werden die Membranströme, die bei den verschiedenen Klemmspannungen gemessen wurden, gegen die Spannung aufgetragen, so ergibt sich eine Strom-Spannungs-Kurve (Abb. 2.4 D). Ein charakteristischer Parameter ist die Steigung (Zellmembranleitwert G). Die im Rahmen dieser Arbeit ausgewerteten Ergebnisse zeigen den Zellmembranleitwert G bei jeweils drei Spannungen an (-80mV; 0mV; 30mV). -100 -80 -60 -40 -20 Abbildung 2.4: Spannungsprotokoll, Ableitungsbeispiele und Darstellung einer IV-Kurve. Dargestellt ist
ein typisches Ableitungsbeispiel einer mit KCNQ1 cRNA injizierten Oozyte (B) gegenüber einer nur mit H2O
injizierten (A). Zur Anwendung kam das Spannungsprotokoll C. Werden die Membranströme, die bei
verschiedenen Klemmspannungen generiert wurden gegen die Spannung aufgetragen, so entsteht eine Strom-
Spannungs-Kurve (D). Der Zeitraum für die Messung des jeweiligen Stromes lag hier zwischen 600-680ms.
Um die Effekte von Carbamazepin (CBZ) und seinem Metaboliten Carbamazepin-10,11- Epoxid (EPX) zu untersuchen, wurden verschiedene Konzentrationen von 3µM bis 100µM (EPX), bzw. 300µM (CBZ) getestet. Da das EPX schlecht wasserlöslich ist, wurde die Stammlösung in DMSO angefertigt und bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur und mit Abschirmung durch einen Faradaykäfig durchgeführt.
2.6.5 Makroskopische Ströme
Durch eine starke Expression von bestimmten Ionenkanalproteinen im Expressionsmodell der Xenopus Oozyte, repräsentiert der Stromfluss über der Membran nahezu ausschließlich den Stromfluss durch diese Kanalproteine. Im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Methode, die sich mit einzelnen Ionenkanälen beschäftigt, werden hier Ströme erfasst, die durch die gesamte Membran einer Zelle fließen. Es werden makroskopische Ströme (I) gemessen, die in einem linearen Verhältnis zur Einzelkanalleitfähigkeit (g), der Offenwahrscheinlichkeit (Popen) und der Menge an Ionenkanälen (N) in der Membran stehen. Demnach lautet die Gleichung: I = N P Betrachtet man die Offenwahrscheinlichkeit von spannungsabhängigen Kanälen, so ist sie nicht konstant sondern steht in Abhängigkeit von Membranpotenzial und Zeit, denn je länger die Membran depolarisiert wird, desto mehr Kanäle befinden sich im geöffneten Zustand. Wie im Ableitungsbeispiel in Abb. 2.4B zu sehen ist, verändert sich der makroskopische Strom über die Zeit der Klemmperiode und erreicht nach einigen Millisekunden einen fast stationären Zustand, der in diesem Beispiel besonders bei positiven Klammspannungen zu beobachten ist. Die durch eine Depolarisation hervorgerufene Aktivierung der spannungsabhängigen Kanäle zeigt im Kurvenverlauf seine charakteristischen Merkmale. So beobachtet man z.B. bei einer KCNQ1/KCNE1 koexprimierenden Oozyte einen sehr langen Aktivierungsverlauf, der selbst bei einem ausgedehnten Klemmprotokoll noch keinen stationären Zustand erreicht (s. Abb. 3.1 G). 2.7 Statistik und Datenauswertungen
Die Datenauswertung erfolgte mit Origin 7.5 und die statistische Signifikanz (P<0.05) zwischen zwei Mittelwerten wurde mit dem Student´s t-Test (Microsoft Excel) geprüft. Die signifikanten Befunde sind mit einem Stern (∗) gekennzeichnet, n stellt die Anzahl der 2.7.1 Ermittlung der apparenten Offenwahrscheinlichkeit I/Imax
I/Imax stellt die apparante Offenwahrscheinlichkeit der untersuchten Kanäle dar. In einigen Veröffentlichungen wird sie auch als Popen bezeichnet (Li et al. 2005; Tatulian et al. 2003). Um I/Imax zu ermitteln, wurden die Tail-Ströme analysiert. Diese so genannten Tail-Ströme lassen sich an einer bestimmten Stelle des Spannungsprotokolls ermitteln und zwar nach dem Klemmsprung auf -30mV, nach einer vorangegangenen depolarisierenden Klemmperiode (s. auch Spannungsprotokoll Abb. 3.1 J, K, Ergebnisse). Die Stromamplituden korrelieren dabei mit der in der vorangegangenen Phase erreichten Offenwahrscheinlichkeit der einzelnen Kanäle. So wurden die Amplituden der Tail-Ströme bei -30mV erfasst und auf die Amplitudenwerte bei +40mV normiert. 3. Ergebnisse
3.1 Wirkung von Carbamazepin auf KCNQ1 Kanäle und akzessorische
KCNE –Untereinheiten
Der KCNQ1-Kaliumkanal kann mit verschiedenen ß-Untereinheiten der KCNE-Familie assoziieren, was das Schaltverhalten beeinflussen kann. Um die Wirkung von Carbamazepin auf den Stromfluss von beschriebenen Kaliumkanälen zu untersuchen, wurden die Oozyten in das Zwei-Elektroden-Spannungsklemmsystem eingespannt. Zuvor wurden den operativ entfernten Xenopus laevis Oozyten die cRNA der zu untersuchenden Kaliumkanälen injiziert und die Oberflächenexpression abgewartet. Die Abbildung 3.1 stellt die charakteristischen Ströme von KCNQ1 (A), KCNQ1/KCNE3 (D) und KCNQ1/KCNE1 (G) injizierten Oozyten dar. Die Originalaufzeichnung der KCNQ1 Homotetramere zeigt einen spannungsabhängigen, langsam aktivierenden Strom. Eine Koexpression mit der KCNE1 Untereinheit veränderte seine Kinetik fundamental. Das führte zu einer mehrfachen Erhöhung der Stromamplitude, einer Verschiebung der Spannungsabhängigkeit um ca. +30mV und einer drastischen Verlangsamung der Aktivierung des Kanals (Abb. 3.1 G). Originalaufzeichnungen der KCNQ1/KCNE3 Ströme hingegen zeigen einen weitgehend zeitunabhängigen Verlauf und eine lineare Strom-Spannungs- Beziehung (Abb. 3.1 D, F). Eine kurze Inkubation der KCNQ1/KCNE3 injizierten Oozyten in einer 100µM CBZ-Lösung zeigte eine Erhöhung der Stromamplituden (Abb. 3.1 E, F). Demgegenüber konnten die Eigenschaften der Ströme, die durch KCNQ1-Kanäle generiert wurden, nicht durch CBZ beeinflusst werden (Abb. 3.1 B, C). Auch wenn sich eine leichte Inhibition der Strom-Spannungs-Kurve bei Zugabe von CBZ (Abb3.1 C) zeigte, so war kein signifikanter Unterschied gegenüber den Kontrollwerten festzustellen. Zu beobachten war jedoch eine Wirkung auf die koexprimierten Kanalproteine KCNQ1/KCNE1, wobei die Amplitudenzunahme in Anwesenheit von CBZ bei positiven Klemmspannungen erfolgte (Abb. 3.1 H, I).
Die Aktivierung der KCNQ1 /KCNE3 Kanäle durch das Antikonvulsivum CBZ bei großeren Spannungen als 0mV wird auch in der Darstellung der Strom-Spannungs-Kurven, die auf die maximale Stromamplitude der Kontrollwerte normiert wurden (Abb. 3.2 A) deutlich. Die Auswertungen der absoluten Ströme bei +30mV ergaben eine Amplitudenzunahme um 18%. -100 -80 -60 -40 -20 E KCNQ1 / KCNE3 + CBZ -100 -80 -60 -40 -20 KCNQ1 / KCNE1 + CBZ -100 -80 -60 -40 -20 Spannungsprotokoll J KCNQ1 und KCNQ1/KCNE3 0 200 400 600 8001000 Abbildung 3.1: Wirkung einer 100µM CBZ-Lösung auf KCNQ1, KCNQ1/KCNE3 und KCNQ1/KCNE1
Kanäle.
Die Grafik zeigt eine typische Aufzeichnung der Ströme einer KCNQ1 (A), KCNQ1/KCNE3 (D) bzw.
KCNQ1/KCNE1 (G) exprimierenden Oozyte unter Kontrollbedingungen, daneben (B, E, H) nach Zugabe einer
100µM CBZ-Lösung. Während die Stromamplitude von KCNQ1 (B) fast unverändert bleibt, erkennt man eine
deutliche Amplitudenzunahme der KCNQ1/KCNE3 (E) und KCNQ1/KCNE1 (H) Ströme nach Zugabe von
CBZ. Das verwendete Spannungsprotokoll für KCNQ1/KCNE1 Kanäle ist in K dargestellt, für KCNQ1 und
KCNQ1/KCNE3 ist der Grafik J zu entnehmen. Die Aufeinanderprojektion der Strom-Spannungs-Kurven unter
Kontrollbedingungen und nach Applikation von CBZ (C, F, I) bestätigen die Befunde.
Bemerkenswert war auch die Veränderung des Leitwertes nach Zugabe von CBZ (Abb. 3.2 B). Während der Leitwert g bei -80mV signifikant erniedrigt war, zeigte sich eine signifikante Steigerung des Leitwertes bei einer Klemmspannung von 0mV und 30mV. Diese Befunde werden durch die Auswertungen der Tail-Ströme und der Darstellung der apparenten Offenwahrscheinlichkeit I/Imax (Abb. 3.2 C) unterstützt. Hier zeigte sich eine erniedrigte Offenwahrscheinlichkeit des konstitutiv offenen KCNQ1/KCNE3 Kanals nach Zugabe von CBZ bei negativen Spannungen. Ein weiterer interessanter Aspekt ist der Einfluss von CBZ auf die Kinetik der KCNQ1/KCNE3 Kanäle. Die Auswertungen der Aktivierungszeitkonstanten tau vor und nach Applikation der Testsubstanz CBZ sind in Abbildung 3.2 D dargestellt. Dazu wurde der Stromverlauf bei einer Klemmspannung von 0mV analysiert und mit einer passenden Exponentialfunktion (Programm Origin 7.5, Exponential; ExpDec1) ausgewertet. Die gegenüber den Kontrollbedingungen signifikant erniedrigte Aktivierungszeitkonstante tau deutet auf eine schnellere Aktivierungskinetik der KCNQ1 /KCNE3 Kanäle nach Zugabe von CBZ hin, wobei sein anschließender zeitunabhängiger Stromverlauf unbeeinflusst blieb. A KCNQ1 / KCNE3 + CBZ KCNQ1 / KCNE3 + CBZ C KCNQ1 / KCNE3 + CBZ -100 -80 -60 -40 -20 -100 -80 -60 -40 -20 0 g at -80mV g at 0mV g at 30mV Abbildung 3.2: Wirkung von 100µM CBZ-Lösung auf KCNQ1/KCNE3
Die Grafik A zeigt anhand der normierten Strom-Spannungskurve-Kurve die Wirkung von CBZ auf die
KCNQ1/KCNE3 Kanäle (n = 21). Die Veränderung des Leitwertes g bei verschiedenen Klemmspannungen ist
im Diagramm B dargestellt. Eine signifikant erniedrigte Aktivierungszeitkonstante tau nach Inkubation mit der
Testsubstanz CBZ gegenüber der Vor- und Nachkontrolle ist der Grafik D zu entnehmen. Die Darstellung der
apparenten Offenwahrscheinlichkeit I/Imax (C) zeigt nach Zugabe von CBZ eine etwas erniedrigte
Offenwahrscheinlichkeit bei negativen Spannungen.

Den aktivierenden Einfluss von CBZ bei positiven Spannungen auf KCNQ1/KCNE3 Kanäle kann man an dem KCNQ1/KCNE1 Kanal in abgeschwächter Form erkennen. Während der Leitwert g bei positiven Klemmspannungen signifikant anstieg (Abb. 3.3 B), blieb die Kinetik des Kanals durch die 100µM CBZ-Lösung unberührt. Aufgrund der charakteristisch langsamen Aktivierungskinetik dieser Kanäle, wurde das Versuchsprotokoll mit entsprechend längeren depolarisierenden Pulsen angepasst. Ausgehend von einem Haltepotenzial von -80mV wurde die Oozytenmembran in 10mV Schritten repetitiv für 2000ms in einer Spanne von -90mV bis +40mV depolarisiert. Im Anschluss an die 2000ms lange Klemmperiode wurde ein Spannungssprung auf -30mV vollzogen. KCNQ1 / KCNE1 + CBZ -100 -80 -60 -40 -20 g at -80mV g at 0mV g at 30mV Abbildung 3.3: Wirkung von CBZ auf KCNQ1/KCNE1 Kanäle
Die Darstellung der normierten Strom-Spannungs-Kurven (A) zeigt eine leichte Amplitudenzunahme bei
positiven Klemmspannungen nach Zugabe von 100µM CBZ-Lösung. Das Diagramm des Leitwertes g bei
verschiedenen Klemmspannungen (B) weist auf die signifikante Zunahme von g bei +30mV hin (n = 17).
Die Abbildung 3.3 A stellt die Strom-Spannungs-Beziehung der aufeinander projizierten Kurven unter Kontrollbedingungen und nach Inkubation von CBZ dar. Ihre Werte wurden am Ende der 2000ms langen Klemmperiode entnommen und auf die maximale Amplitude der Kontrollwerte normiert. Daraus lässt sich schließen, dass die beiden Kurven bis 0mV deckungsgleich verlaufen und eine signifikante stimulierende Wirkung auf die Stromamplitude des heteromeren KCNQ1/KCNE1 Kanals erst bei einer Spannung ab +30mV zu erkennen ist. Insgesamt stieg die Amplitude um 16% an. Die aktivierende Wirkung von CBZ war sowohl bei KCNQ1/KCNE3 als auch KCNQ1/KCNE1 Kanälen 3.2 Untersuchungen der neuronalen KCNQ2/KCNQ3 Kanäle nach Zugabe
von Carbamazepin
Nachdem ein aktivierender Einfluss von CBZ bei positiven Spannungen auf heteromere KCNQ1/KCNE3 und KCNQ1/KCNE1 Kanäle beobachtet wurde, kam die Frage auf, ob die neuronalen KCNQ-Kanäle ebenfalls von CBZ beeinflusst werden. KCNQ2 und KCNQ3 sind Kanäle, die ausschließlich im neuronalen Gewebe exprimiert werden (Biervert et al. 1998;(Yang et al. 1998)). Sie vermitteln bei Depolarisation langsam aktivierende Kaliumauswärtsströme, die nach Repolarisation langsam deaktivieren und tragen damit zur Stabilisierung des Membranpotenzials bei. Wie schon beschrieben, führen genetische Defekte in einer der beiden Untereinheiten zu unkontrollierter neuronaler Eine Koexpression der beiden KCNQ2 und KCNQ3 Heteromere führt, im Vergleich zu den beiden homotetrameren Kanälen alleine, zum Anstieg der Stromamplitude um das zehnfach und ist auf die erhöhte Anzahl funktioneller Kanäle in der Membran zurückzuführen (Schwake et al. 2000). Die Abbildung 3.4 A zeigt die für KCNQ2/KCNQ3 charakteristisch großen Ströme. Eine kurzzeitige Inkubation der KCNQ2/KCNQ3 exprimierenden Oozyte in einer 100µM CBZ-Lösung führte zu einer leichten Verminderung der Gesamtstromamplitude (Abb. 3.4 B). Die Analysen weiterer dreizehn Experimente sind in Form einer normierten Strom-Spannungs-Kurve zusammengefasst und zeigen eine signifikante Inhibition der Stromamplitude zwischen 9% und 11% bei Spannungschritten von -20mV bis +10mV gegenüber den KCNQ2/KCNQ3 Strömen unter Kontrollbedingungen (Abb. 3.4 C). Bei positiveren Klemmspannungen als +10mV konnte die Reduktion der Stromamplitude nicht mehr als signifikant bestätig werden. Bei negativen Klemmspannungen blieb der Leitwert der KCNQ2/KCNQ3 Kanäle durch das Antiepileptikum CBZ unverändert, während sich eine signifikante Reduktion bei +30mV zeigte (Abb. 3.4 D). Nach einer Auswaschperiode war die Wirkung von CBZ reversibel. KCNQ2 / KCNQ3 + CBZ -100 -80 -60 -40 -20 0 KCNQ2 / KCNQ3 + CBZ g at -80mV g at 0mV g at 30mV Abbildung 3.4: Wirkung von CBZ auf KCNQ2/KCNQ3 Kanäle. Typische Stromableitung an einer
KCNQ2/KCNQ3 exprimierenden Oozyte (A), zeigt nach Zugabe von 100µM CBZ-Lösung (B) eine leicht
verringerte Stromamplitude. Die Darstellung der aufeinander projizierten Strom-Spannungs-Kurven (C) und des
Leitwertes g bei unterschiedlichen Klemmspannungen (D) zeigt ebenfalls eine leichte Inhibition der
Stromamplitude bei positiven Spannungen und einen signifikant erniedrigten Leitwert bei 30mV (n = 13). Das
verwendete Spannungsprotokoll ist in Abb. 3.1 K dargestellt.
3.3 Wirkung von Carbamazepin auf homomere KCNQ2 und KCNQ3
Ein leicht inhibierender Effekt von CBZ auf die koexprimierten KCNQ2/KCNQ3 Kanäle veranlasste die experimentelle Überprüfung der Wirkung auch auf einzeln exprimierte KCNQ2 und KCNQ3 Kanalproteine. Diese Fragestellung ist ebenfalls unter dem Aspekt interessant, dass in einigen Neuronen nur eine der beiden Untereinheiten exprimiert wird (Cooper et al. 2000). Die Auswertungen der Originalstromableitungen von KCNQ2 oder KCNQ3 exprimierenden Oozyten (Abb. 3.5 A und D) zeigen zunächst, dass die KCNQ3 Ströme mehr als das 10-fache kleiner sind als KCNQ2 Ströme. Die Zugabe von 100µM CBZ-Lösung hatte keine Wirkung auf den KCNQ2 Stromfluss (Abb. 3.5 B), während die Stromamplitude der KCNQ3 Homomere deutlich anstieg (Abb3.5 E, F). Bemerkenswert war das Muster der spannungsabhängigen Empfindlichkeit der KCNQ3 Kanälen auf CBZ. Bei einer Klemmspannung von -30mV aktivierte CBZ die absoluten Ströme um 23%, bei Spannungen von -20mV bis +10mV stieg die Stromamplitude um 15-18% an und bei +20mV war die Aktivierung von nur noch 11% zu registrieren. Die Werte bei höheren Klemmspannungen fielen weiter ab und erreichten nicht das Signifikanzniveau. KCNQ2 + 100µM CBZ -100 -80 -60 -40 -20 KCNQ3 + 100µM CBZ -100 -80 -60 -40 -20 g at -80mV g at 0mV g at 30mV
g at -80mV g at 0mV g at 30mV
Abbildung 3.5: Wirkung einer 100µM CBZ-Lösung auf KCNQ2 und KCNQ3 Kanäle
Die Stromableitung einer Oozyte, die KCNQ2 (A) und KCNQ3 (D) exprimiert, sowie die normierten Strom-
Spannungs-Kurven (C; n =13, F; n = 5) sind vor und nach Zugabe von einer 100µM CBZ-Lösung dargestellt.
Das Diagramm G und H zeigt den Leitwert g bei angegebenen Klemmspannungen unter Einfluss von CBZ. Das
verwendete Spannungsprotokoll gleicht dem in Abb. 3.1 K.
Die Auswertungen des Leitwertes g bei -30mV, 0mV und 30mV zeigten allerdings, dass CBZ weder auf den KCNQ2- noch auf den KCNQ3-Leitwert einen signifikanten Einfluss ausgeübt hat (Abb. 3.5 G, H). Zusammenfassend konnte beobachtet werden, dass die Anwesenheit von CBZ einen spannungsabhängigen Anstieg bewirkte, was in Übereinstimmung mit der antikonvulsiven Wirkung von CBZ in Zusammenhang stehen könnte. KCNQ2 Kanäle dagegen zeigten keine Veränderung der Stromamplitude nach Zugabe von CBZ. Bei koexprimierten KCNQ2/KCNQ3 Kanälen konnte in Anwesenheit von CBZ eine leichte Inhibition der Gesamtstromamplitude bei Spannungen ab -20mV beobachtet Die Analyse der Tail-Ströme, die in der Darstellung der apparenten Offenwahrscheinlichkeit I/Imax beschrieben werden (Abb. 3.6 A und B) zeigte, dass CBZ keinen Einfluss auf die Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ3 und KCNQ2/KCNQ3 Kanäle hatte. B KCNQ2 / KCNQ3 + CBZ C -100 -80 -60 -40 -20 0 -100 -80 -60 -40 -20 0 -100 -80 -60 -40 -20 0 Abbildung 3.6: Darstellung der apparanten Offenwahrscheinlichkeit I/Imax.
Die Anwesenheit von 100µM CBZ-Lösung zeigt keinen Einfluss auf die Offenwahrscheinlichkeit der
KCNQ3(A) und KCNQ2/KCNQ3 Kanäle (B). KCNQ2 Kanäle (C) jedoch scheinen nach Zugabe von CBZ eine
geringfügig erhöhte Offenwahrscheinlichkeit aufzuzeigen, die jedoch nicht signifikant ist.
Allerdings konnte eine leicht erhöhte Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ2 Kanäle nach Zugabe von CBZ (Abb. 3.6 C) beobachtet werden (Halbmaximalen Aktivierung V1/2 unter Kontrollbedingungen (-28,87±0,75) und in Anwesenheit von CBZ (-31,41±0,71)), die jedoch nicht das festgelegte Signifikanzniveau erreicht hat. Die Werte für die halbmaximale Aktivierung V1/2 wurden durch die Anwendung des Boltzmann Fits auf die I/Imax Kurve 3.4 Wirkung von Carbamazepin auf KCNQ5 Kanäle; Vergleich zu
Carbamazepin 10,11-Epoxid
Ein weiterer, in Neuronen exprimierter Kanal der KCNQ Genfamilie, ist KCNQ5. Er weist eine breite Expression im Gehirn auf und, anders als seine anderen vier KCNQ Familienmitglieder ebenfalls im Skelettmuskel (Schroeder et al.2000a). Untersucht wurde im Rahmen dieser Arbeit sowohl die Wirkung von CBZ als auch seines Metaboliten EPX. Die Originalaufzeichnungen zeigen zunächst wie langsam aktivierende KCNQ5 Ströme durch die Zugabe von 100µM CBZ-Lösung und auch 100µM EPX-Lösung unterschiedlich stark inhibiert werden (Abb. 3.7 A, D). -100 -80 -60 -40 -20 g at -80mV g at 0mV g at 30mV -100 -80 -60 -40 -20 Abbildung 3.7: Vergleich der Wirkung von CBZ und EPX auf KCNQ5 Kanäle.
Die Stromableitung einer KCNQ5 exprimierenden Oozyte zeigt nach Zugabe von 100µM CBZ-Lösung (A) und
100µM EPX-Lösung (D) eine unterschiedlich starke Hemmung der Stromamplituden. Das dazugehörige
Spannungsprotokoll ist in G abgebildet. Auch die Gegenüberstellung der aufeinander projizierten Strom-
Spannungs-Kurven vor und nach Zugabe der beiden Testsubstanzen spiegelt die unterschiedlich starke Inhibition
der Stromamplitude wieder (B, E). Die Wirkungsunterschiede von CBZ und EPX werden in der Darstellung des
Leitwertes g bei verschiedenen Klemmspannungen sehr deutlich (C, F). (n = 7)
Auch aus der Darstellung der Strom-Spannungs-Kurven (Abb. 3.7 B, E) wird deutlich, dass KCNQ5 Ströme viel empfindlicher auf die Zugabe von EPX reagieren als auf CBZ. Die Auswertungen weiterer Experimente ergaben einen signifikant höheren Leitwert der KCNQ5 Kanäle bei -80mV nach Zugabe von EPX, wobei der Leitwert bei 0mV und 30mV eine drastische Reduktion aufzeigte (Abb. 3.7 F). Demgegenüber vermittelte die Wirkung von CBZ bei allen analysierten Klemmspannungen eine annährend gleichstarke Reduktion der KCNQ5 Leitwerte, die jedoch nur bei 0mV und 30mV die Signifikanz erreichten (Abb. 3.7 Ein weiterer interessanter Aspekt der Wirkung von EPX, die sich von der CBZ Wirkung auf KCNQ5 Kanäle deutlich abhebt, ist die veränderte Kinetik der KCNQ5 vermittelten Ströme (Abb. 3.8) in Anwesenheit von EPX. Die Analyse der Aktivierungsparameter tau1 und tau2, die sich aus dem Fit des Kurvenverlaufs bei 0mV ermitteln liesen, zeigten in Anwesenheit von EPX eine signifikant erniedrigte Aktivierungszeitkonstante tau1 (Abb. 3.8 A, B). Bei näherem Betrachten der Stromverläufe, die in der Grafik 3.8 A abgebildet sind, fällt auf, dass die rote Kurve, neben der erniedrigten Stromamplitude, initial auch einen viel steileren Verlauf ausweist, als die schwarze Stromkurve unter Kontrollbedingungen. Dieser initial steilere Verlauf spiegelt eine schnellere Aktivierungskinetik der KCNQ5-Ströme nach Zugabe von EPX wieder. Während dieser Effekt nach einer kurzen Auswaschperiode vollkommen reversibel zu sein scheint, war der Aktivierungsparameter tau2, der die langsamere Komponente des Kurvenverlaufs beschreibt, auch nach dem Auswaschen signifikant gegenüber der Kontrolle erniedrigt (Abb.3.8 C). Die fehlende Signifikanz der tau2 Werte in Anwesenheit von EPX kann möglicherweise mit einer größeren Streuung der Daten erklärt werden, wobei sich die anhaltende Reduktion der Aktivierungszeitkonstanten tau2 nach der Auswaschperiode womöglich als kumulative Nachwirkung von EPX interpretiert werden könnte (Abb.3.8 C). Ingesamt lässt sich die Wirkung von EPX auf die Kinetik des KCNQ5- Stromes als auch auf die Reduktion der Stromamplitude als partiell reversibel einstufen. Abbildung 3.8: EPX verändert die Kinetik der KCNQ5-Ströme
Die Grafik A zeigt einen Ausschnitt aufeinander projizierter Originalstromableitungen einer KCNQ5
exprimierenden Oozyte unter Kontrollbedingungen, nach EPX Zugabe und nach der Auswaschperiode. Dieser
Ausschnitt spiegelt den Stromfluss bei 0mV wieder und zeigt nach Zugabe von EPX eine schnellere
Aktivierungskinetik, die aufgrund des Kurvenverlaufs als tau1 (schnelle Komponente, B) und tau2 (langsame
Komponente, C) analysiert wurde (n = 7).
Um die pharmakologische Wirkung von CBZ und EPX genauer zu untersuchen, wurden weitere Konzentrationen getestet. Es zeigte sich eine konzentrationsabhängige Inhibition der KCNQ5-Stromamplitude nach Zugabe von CBZ, wobei die Inhibition in Anwesenheit von EPX wesentlich stärker ausfiel. Zur Darstellung der experimentellen Konzentrationen beider Testsubstanzen wurden jeweils die gleichen Farben verwendet, um den Vergleich der Wirkung untereinander zu erleichtern. Es wurden Konzentrationen von 3µM (grün), 10µM (magenta), 100µM (rot) und bei CBZ zusätzlich noch 300µM (hellblau) getestet. Die graue Farbe beschreibt den Zustand nach der Auswaschperiode. Auf Grund der geringen Löslichkeit von EPX, konnten Konzentrationen größer als 100µM nicht getestet werden. Der Vergleich der auf einander projizierten normierten Strom-Spannungs-Kurven (Abb. 3.9 A, D) zeigt nicht nur einen konzentrationsabhängigen Unterschied der Reduktion der Stromamplituden, sondern auch einen unterschiedlichen Einfluss der beiden Testsubstanzen auf die Spannungsabhängigkeit des Stromes. Während die KCNQ5 Ströme unter Kontrollbedingungen ab -60mV langsam aktivierten, wurde nach Zugabe von CBZ bei einer Konzentration von 10µM die Inhibition der Stromamplitude ab etwa -30mV sichtbar (Abb. 3.9 A). Im Vergleich dazu bewirkte die 10µM EPX-Lösung eine signifikante Reduktion der Stromamplitude ab -50mV (Abb.3.9 D). Die Ströme wurden bei +30mV genauer untersucht (Abb. 3.9 B, E), dabei zeigte sich schon bei einer Konzentration von 3µM EPX-Lösung eine hochsignifikante Reduktion der Ströme um 37%, 10µM EPX-Lösung erreichte eine Reduktion sogar um 63%. Auffällig ist, dass eine 10fach höhere Konzentration von EPX (100µM) eine geringfügigere Inhibition (58%) der Gesamtstromamplitude bewirkte (Abb. 3.9 E). Im Unterschied dazu liesen sich die KCNQ5 Ströme erst bei einer Konzentration von 10µM CBZ signifikant reduzieren, wobei auch die höchste getestete Konzentration von CBZ (300µM) nicht die Größenordnung der EPX Inhibition erreichte. Auf Grund der geringen Löslichkeit der Testsubstanzen konnten keine höheren Konzentrationen getestet werden. So lässt sich der IC50 Wert nur eingrenzen. Anzunehmen ist, dass der IC50 Wert von CBZ deutlich >300µM ist, während sich der IC50
Wert für EPX bei 8,1±0,7 µM (Programm Origin 7.5, Logistic) befindet. Des Weiteren zeigte sich auch die unterschiedliche Wirkung der beiden Testsubstanzen auf das Membranpotenzial (Abb. 3.9 C, F) der KCNQ5 exprimierenden Oozyten. Nach Zugabe von 10µM und 100µM EPX-Lösung konnte eine signifikante Hyperpolarisation der Oozytenmembran beobachtet werden. Dieser Befund deckt sich gut mit der schon gezeigten Erhöhung des Leitwertes bei - 80mV (Abb. 3.7 F) und könnte auf der Erhöhung des fraktionellen Leitwertes für Kalium in der Oocyte beruhen (s. Kap.1.2). KCNQ5 + CBZ
con 3µM 10µM 100µM ncon -100 -80 -60 -40 -20 con 3µM 10µM 100µM 300µM nco Membranpotenzial
KCNQ5 + EPX
con 3µM 10µM 100µM ncon -100 -80 -60 -40 -20 con 3µM 10µM 100µM nc Abbildung 3.9: Konzentrationsabhängige Wirkung von CBZ und EPX auf KCNQ5 Kanäle.
Die Darstellung der normierten Strom-Spannungs-Kurven zeigt einen unterschiedlich starken Einfluss von CBZ
(A) und EPX (D) auf KCNQ5 Kanäle (n=7). Die Ströme bei +30mV werden durch eine 300µM CBZ
Konzentration bis zu 43% gehemmt (B), während eine 10µM Konzentration von EPX schon 63% des KCNQ5-
Stromflusses reduziert (E). Zusätzlich lässt sich nach Zugabe von EPX eine signifikante Hyperpolarisation des
Membranpotenzials registrieren (F), CBZ dagegen zeigt keinen Einfluss darauf (C).
Auch die Auswertungen der Tail-Ströme, die in der Darstellung der apparenten Offenwahrscheinlichkeit I/Imax (Abb. 3.10 A, B) veranschaulicht werden, lassen die unterschiedliche Wirkung der beiden Testsubstanzen erkennen. Dazu wurden die Stromamplituden der Tail-Ströme nach einer 2s langen Phase eines definierten Membranpotenzials zwischen -90 mV und +40 mV gemessen. Beide Graphen (Abb. 3.10) zeigen unter Kontrollbedingungen (schwarz) eine Aktivierung des KCNQ5-Kanals ab -60mV, wobei bei stark positiven Spannungen die I/Imax- Kurve wieder abzufallen scheint. Ein derartiger Abfall der I/Imax-Kurve könnte einen Inaktivierungsvorgang bei positiven Spannungen widerspiegeln, was auch bei einigen anderen KCNQ-Kanälen zu beobachtet ist (Jensen et al. 2007; Tatulian et al. 2001). Dieser Inaktivierungsvorgang scheint nach Zugabe von EPX um etwa 20mV nach links verschoben zu sein (Abb. 3.10 B). Diese Gegenüberstellung zeigt deutlich, dass CBZ die Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ5 Kanäle nicht beeinflusst hat (Abb. 3.10 A), während die Anwesenheit von EPX eine Linksverschiebung der I/Imax Kurve bewirkte (Abb. 3.10 B). 3µM EPX 10µM EPX 100µM EPX -100 -80 -60 -40 -20 0 -100 -80 -60 -40 -20 0 Abbildung 3.10: Gegenüberstellung der unterschiedlichen Wirkung von CBZ und EPX auf KCNQ5-Tail-
Ströme. Die Darstellungen der apparenten Offenwahrscheinlichkeit I/Imax von KCNQ5 Kanälen nach Zugabe
von CBZ (A) und EPX (B) zeigen, dass nur die Anwesenheit von EPX eine Linksverschiebung der I/Imax Kurve Das bedeutet, dass eine höhere Anzahl von Kanälen bei negativeren Membranpotenzialen durch EPX geöffnet wurde. Als Werte für die halbmaximale Aktivierung wurden unter Kontrollbedingungen V1/2 = -41,59 ± 0,42 mV, bei 3µM EPX V1/2 = -46,6 ± 4,0 mV, 10µM EPX V1/2 = -53,16 ± 2,3 mV und bei 100µM V1/2 = -50,2 ± 1,54 mV, berechnet. Deutlich wird auch hier, dass die 10µM EPX-Lösung einen viel stärkeren Effekt auf die KCNQ5 Kanäle ausgeübt hat, als 100µM EPX-Lösung. 3.5 Wirkung von Carbamazepin auf heteromere KCNQ5 / KCNQ3 Kanäle;
Vergleich zu Carbamazepin 10,11-Epoxid
Da KCNQ5 mit KCNQ3 in vitro heteromere Kanäle bilden kann, die ebenfalls Eigenschaften des M-Stroms aufweisen (Wickenden et al. 2001), wurde eine weitere Testreihe zur pharmakologischen Untersuchung von CBZ und EPX durchgeführt. Wie schon beschrieben, sind KCNQ3 Ströme sehr klein und sind oft nicht von Hintergrundströmen einer Xenopus Oozyte zu unterscheiden. Eine Koexpression von KCNQ3 mit KCNQ5 führte zu einer eindeutig höheren Stromamplitude, gegenüber dem jeweiligen Homomer. Auch diese Ströme waren empfindlich auf die CBZ und EPX Zugabe und reagierten mit einer unterschiedlich starken Abnahme der Stromamplitude (Abb. 3.11 A, D). Dabei fiel auf, dass die langsam aktivierenden KCNQ5/KCNQ3 Ströme nach Zugabe von 100µM EPX-Lösung nicht nur an Amplitudenhöhe verloren haben, sondern sich darüber hinaus auch die Spannungsabhängigkeit änderte. Die KCNQ5/KCNQ3 Kanäle zeigten in Anwesenheit von 100µM EPX-Lösung, im Gegensatz zur gleichen Konzentration von CBZ, eine wesentlich frühere Aktivierung, was im Vergleich der Strom-Spannungs-Kurven (Abb. 3.11 B, E) deutlich wurde. Hier konnte eine Aktivierung der KCNQ5/KCNQ3 Ströme nach Inkubation mit EPX schon ab -80mV beobachtet werden, während unter Kontrollbedingungen die Aktivierung ab -60mV deutlich wurde. Auch die Auswertungen des Leitwertes der KCNQ5/KCNQ3 Kanäle bei -80mV, 0mV und +30mV zeigten eine unterschiedlich starke Wirkung von 100µM CBZ-Lösung gegenüber der gleichen Konzentration der EPX-Lösung (Abb. 3.11 C, F). Beide Testsubstanzen bewirkten bei einer Spannung von -80mV eine signifikante Steigerung des Leitwertes in Anwesenheit von EPX sogar auf das Doppelte, während bei Spannungen um 0mV eine signifikante Reduktion des KCNQ5/KCNQ3–Leitwertes beobachtet werden konnte. Bei positiven Klemmspannungen machte sich bei beiden Testsubstanzen kaum eine Änderung des Leitwertes bemerkbar, wobei die Stromamplituden in diesem Spannungsbereich am stärksten auseinanderweichten. Das kann dadurch erklärt werden, dass die Darstellung des Leitwertes g durch die Steigung der Strom-Spannungs-Kurve bei angegebenen Spannungen ermittelt wurde und bei +30mV erreichte dieser Kanal einen nahezu stationären Zustand, so dass die ermittelte Steigung sowohl unter Kontrollbedingungen, als auch nach Zugabe der Testsubstanzen vergleichbar war, obwohl sich der Amplitudenunterschied sehr deutlich A KCNQ5/KCNQ3 + CBZ B KCNQ5/KCNQ3 + CBZ C KCNQ5/KCNQ3 + CBZ -100 -80 -60 -40 -20 g at -80mV g at 0mV g at 30mV D KCNQ5/KCNQ3 + EPX E KCNQ5/KCNQ3 + EPX KCNQ5/KCNQ3 + EPX -100 -80 -60 -40 -20 g at -80mV g at 0mV g at 30mV Abbildung 3.11: Vergleich der Wirkung von 100µM CBZ- und EPX-Lösung auf KCNQ5/KCNQ3
Heteromere.
Ein Ausschnitt einer typischen Stromableitung einer KCNQ5/KCNQ3 exprimierenden Oozyte
zeigt nach einer kurzen Inkubation mit 100µM CBZ-Lösung (A) und einer 100µM EPX-Lösung (D) eine
deutliche Reduktion der Stromamplitud. (Das Spanungsprotokoll gleicht dem in Abbildung 3.7 G.) Diese
unterschiedlich starke Wirkung wird auch in der Gegenüberstellung der Strom-Spannung-Kurven sichtbar (B,
E), wobei die signifikante Veränderung des Leitwertes g bei -80mV und 0mV diesen unterschiedlich starken
Effekt der beiden Testsubstanzen hervorhebt (C, F). (n = 9)
Die Untersuchungen weiterer Konzentrationen von CBZ und EPX haben einen Unterschied in der Empfindlichkeit der KCNQ5/KCNQ3 Ströme gezeigt. Dabei hat die Zugabe von EPX bei allen drei getesteten Konzentrationen (3µM; 10µM; 100µM) einen gleich starken Maximaleffekt bewirkt, der bei stark negativen Spannungen eine frühere Aktivierung der KCNQ5/KCNQ3 Ströme vermittelte und gleichzeitig ab einer Spannung von -30mV eine Inhibition der Stromamplituden zeigte (Abb. 3.12 D). Die analysierten Ströme bei +30mV haben bei allen drei Konzentrationen eine signifikante Reduktion der Stromamplituden um 30% gezeigt, wobei nach der Auswaschperiode noch eine Amplitudenrückgang von weiteren 7% beobachtet wurde (Abb. 3.12 E), die Wirkung war also nicht reversibel. Membranpotezial KCNQ5/KCNQ3 + CBZ KCNQ5 / KCNQ3 + CBZ KCNQ5/KCNQ3 + CBZ con 3µM 10µM 100µM ncon -100 -80 -60 -40 -20 con 3µM 10µM 100µM 300µM nco D KCNQ5/KCNQ3 + EPX E Membranpotenzial KCNQ5 / KCNQ3 + EPX KCNQ5/KCNQ3 + EPX con 3µM 10µM 100µM ncon -100 -80 -60 -40 -20 con 3µM 10µM 100µM nco Abbildung 3.12: Wirkung von CBZ und EPX auf KCNQ5 / KCNQ3 Kanäle
Die auf einander projizierten Strom-Spannungs-Kurven, die auf die maximale Amplitude der Kontrollwerte
normiert wurden, zeigen eine konzentrationsabhängige Wirkung von CBZ (A) und eine spannungsabhängige
Wirkung von EPX (D). Die Analyse der Ströme bei +30mV stellen die signifikanten Befunde prozentual dar (B,
E). Grafik C und F zeigen den Einfluss der beiden Testsubstanzen auf das Membranpotenzial. (CBZ n = 9; EPX
n = 6)
Im Gegensatz dazu steht die Wirkung von CBZ. Es konnte ein konzentrationsabhängiger Effekt auf die KCNQ5/KCNQ3 generierten Ströme beobachtet werden (Abb. 3.12 A, B), der bei der niedrigsten getesteten Konzentration von 3µM sogar eine signifikante Aktivierung der Ströme um 5% provozierte, was sich allerdings nur bei positiven Spannungen bemerkbar machte. Höhere Konzentrationen von CBZ (100µM und 300µM) hatten dagegen eine signifikant inhibierende Wirkung auf die Stromgröße. Ingesamt konnte eine Reduktion der Stromamplitude bei einer Spannung von +30mV und 100µM CBZ-Lösung um gerade 13% beobachtet werden, 300µM CBZ-Lösung bewirkte einen Rückgang um 41% (Abb. 3.12 B). Im Gegensatz zu der Wirkung von EPX, war eine Erhöhung der Stromamplitude nach dem Auswaschen der CBZ-Lösung sichtbar, diese war jedoch noch signifikant unterschiedlich gegenüber der Vorkontrolle (Abb. 3.12 B, E). Das bedeutet, die Wirkung war teilweise Einen weiteren Unterschied stellt die Wirkung von EPX auf das Membranpotenzial dar. Während keine der getesteten CBZ Konzentrationen einen Einfluss auf das Membranpotenzial von KCNQ5/KCNQ3 Kanälen gezeigt hat, bewirkten alle EPX- Konzentrationen eine signifikante Hyperpolarisation der Membran (Abb. 3.12 C, F). Im Gegensatz zu der Wirkung auf die Stromamplitude war dieser Effekt reversibel. Die Auswertungen der Tail-Ströme zeigen, dass beide Testsubstanzen die Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ5/KCNQ3 Kanäle beeinflusst haben, jedoch im unterschiedlichen Ausmaß (Abb. 3.13 A, B). Aus dem Vergleich der beiden I/Imax Kurven geht hervor, dass CBZ nur eine geringfügig erhöhte Offenwahrscheinlichkeit bewirken konnte (Kontrolle V1/2= -30,4 ± 0,67 mV; 10µM V1/2= -31,5 ± 0,9 mV und 100µM V1/2= -31,9 ± 0,8 mV), während die Anwesenheit von EPX schon ab einer Konzentration von 3µM eine deutliche Linksverschiebung in Richtung hyperpolarisierender Spannungen bewirkt hat (3µM EPX V1/2= -45,6 ± 3,1 mV; 10µM EPX V1/2= -50,4 ± 3,8 mV ; 100µM -54,1 ± 3,4 mV; Kontrolle V1/2= -30,7 ± 2,7 mV ). A KCNQ5 / KCNQ3 + CBZ B KCNQ5 / KCNQ3 + EPX 0 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 -100 -80 -60 -40 -20 0 Abbildung 3.13: Darstellung der apparenten Offenwahrscheinlichkeit I/Imax. Die Anwesenheit von CBZ
bewirkt eine leicht erhöhte Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ5/KCNQ3 Kanäle (A) bei negativen Spannungen.
Die Inkubation der KCNQ5/KCNQ3 Kanäle mit EPX (B) dagegen zeigt eine deutliche Linksverschiebung der
I/Imax Kurve.

Diese Ergebnisse, zusammen mit den einzugrenzenden IC50 Werten für CBZ (>300µM) und EPX (1,3 ± 0,9 µM unter der Annahme, dass eine maximal Inhibition von nur 30% (Abb. 3.12 E) möglich ist) zeigen eine komplexe Wirkung der beiden Testsubstanzen auf KCNQ5/KCNQ3 Kanäle. EPX zeigte dabei deutlich stärkere Auswirkungen. 3.6 Wirkung von Carbamazepin-10,11-Epoxid auf homomere KCNQ3
Kanäle im Vergleich zu KCNQ5/KCNQ3 und KCNQ5 Kanälen
Der sowohl in zentralen als auch peripheren Neuronen lokalisierte KCNQ3 Kanal hat im Oozytenexpressionssystem in Anwesenheit von CBZ eine signifikante Aktivierung seiner Stromamplitude bei Spannungen von -30mV bis +20mV gezeigt, was nicht auf eine erhöhte Offenwahrscheinlichkeit oder signifikant erhöhte Leitwerte zurückzuführen ist (Kap.3.3). Etwas anders sehen die Ergebnisse nach Zugabe von EPX aus. Eine Originalaufzeichnung der KCNQ3 Ströme bei +40mV zeigt zunächst einen typischen Stromverlauf unter Kontrollbedingungen, der nach Zugabe einer 100µM EPX-Lösung eine Erhöhung der Stromamplitude beschreibt (Abb. 3.14 A, B). Die genauere Analyse der Strom-Spannungs- Beziehung ergab einen signifikanten Anstieg der Ströme um etwa 20% bei Spannungen von - 20mV bis +30mV, bei Klemmspannungen von +40mV war eine Erhöhung der Stromamplitude von 27% gegenüber den Kontrollwerten zu registrieren. Des Weiteren war eine Zunahme des KCNQ3-Leitwertes zu beobachten, der bei -80mV und +30mV statistisch signifikant war (Abb. 3.14 C). Diese Leitwerterhöhung lässt eine Hyperpolarisation des Membranpotenzials erwarten. Das zeigte sich aber nur sehr geringfügig in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von EPX, wobei keiner der Werte das Signifikanzniveau erreichen konnte (Abb. 3.15 C). -100 -80 -60 -40 -20 g at -80mV g at 0mV g at 30mV Abbildung 3.14: Wirkung von 100µM EPX-Lösung auf KCNQ3
Die Grafik A zeigt einen Ausschnitt einer Originalableitung einer KCNQ3 exprimierenden Oozyte unter
Kontrollbedingungen und nach Zugabe einer 100µM EPX-Lösung. Deutlich wird auch in der Darstellung der
Strom-Spannungs-Kurven, dass EPX einen aktivierenden Einfluss auf die Stromamplitude vermittelt (B). Auch
der Leitwert der KCNQ3 Kanäle steigt in Anwesenheit von EPX (C). (n = 5)
Weitere Analysen der Stromamplitude ergaben eine Erhöhung ab einer Konzentration von
10µM EPX, wobei interessanterweise die Stärke der Wirkung vergleichbar mit einer 10fach höheren Konzentration war (Abb. 3.15 A, B). Diese etwa 20%ige Zunahme der Stromamplitude war nach einer Auswaschperiode nur partiell reversibel, was aus der Darstellung der Ströme bei +30mV (Abb. 3.15 B) zu entnehmen ist. Membranpotenzial con 3µM 10µM 100µM ncon -100 -80 -60 -40 -20 con 3µM 10µM 100µM ncon Abbildung 3.15: Konzentrationsabhängige Wirkung von EPX auf KCNQ3 Kanäle
Die normierten Strom-Spannungs-Kurven zeigen in Anwesenheit von EPX eine Erhöhung der Stromamplituden
(A), die in Abhängigkeit von der Konzentration bei positiven Spannungen bis zu 20% steigt (B). Die Analyse
des Membranpotenzials zeigt eine geringfügige Hyperpolarisation, die jedoch nicht signifikant ist (C). (n = 5)
Werden diese Befunde mit der Wirkung von EPX auf KCNQ5 und koexprimierte KCNQ5/KCNQ3 Kanäle verglichen, so wird eine vollkommen gegensätzliche Reaktion dieser drei Kanäle nach Zugabe von EPX deutlich. Der Vergleich der Ströme bei positiven Klemmspannungen (+30mV) zeigt schon bei der kleinsten getesteten EPX Konzentration (3µM) eine signifikante Inhibition der KCNQ5 (um 37%) und KCNQ5/KCNQ3 (um 31%) generierten Ströme (Abb. 3.9 E; Abb. 3.12 E). Höhere Konzentrationen von EPX zeigen nur bei KCNQ5 Kanälen eine noch stärkere Reduktion der Stromamplituden. Diese Beobachtung kann möglicherweise durch die Befunde der EPX Wirkung auf KCNQ3 Kanäle erklärt werden. Hier wurde ein Anstieg der KCNQ3 Stromamplitude um 20% registriert (Abb. 3.15), der möglicherweise bei der Koexpression von KCNQ5/KCNQ3 einer stärkeren Strominhibition entgegenwirkte. Bei diesem Vergleich der Wirkung von EPX werden auch Gemeinsamkeiten deutlich. 100µM EPX-Lösung vermittelte bei allen drei neuronalen Kanälen eine Erhöhung des Leitwertes bei stark negativen Spannungen (Abb. 3.11F; Abb. 3.7F; Abb. 3.14C). Bei allen drei Kanälen machte sich auch eine Wirkung auf das Membranpotenzial bemerkbar. KCNQ5/KCNQ3 und KCNQ5 Kanäle zeigten dabei eine signifikante Hyperpolarisation, die bei KCNQ3 Kanälen nur sehr schwach ausfiel und nicht signifikant war (Abb. 3.9 F; Abb. 3.12 F; Abb. 3.15 C). Des Weiteren war die Wirkung von EPX auf diese Kanäle nur partiell reversibel (Abb. 3.9E; 3.12E; 3.15B). Insgesamt war die Wirkung von EPX am stärksten bei koexprimierten KCNQ5/KCNQ3 Kanälen ausgeprägt. B KCNQ5 / KCNQ3 + EPX 3µM EPX 10µM EPX 100µM EPX 0 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 -100 -80 -60 -40 -20 0 -100 -80 -60 -40 -20 0 Abbildung 3.16: Wirkung von EPX auf KCNQ3, KCNQ5 und KCNQ5/KCNQ3 Tail-Ströme. Die
Darstellungen der apparenten Offenwahrscheinlichkeit I/Imax von KCNQ3 (A), KCNQ5 (C) und
KCNQ5/KCNQ3 (B) Kanälen zeigt einen unterschiedlich starken Einfluss von EPX auf die
Offenwahrscheinlichkeit dieser Kanäle.

Diese Befunde lassen sich durch die Auswertungen der Tail-Ströme gut veranschaulichen
(Abb. 3.16). Während sich die Anwesenheit von EPX nur sehr geringfügig auf die Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ3 Kanäle auswirkte (Abb. 3.16 A), zeigte sich der Einfluss auf heteromere KCNQ5/KCNQ3 Kanäle am stärksten (Abb. 3.16 B). Der Vergleich der Werte für die halbmaximale Aktivierung nach Zugabe von 100µM EPX-Lösung bestätigte diese Befunde mit einer Verschiebung der KCNQ5/KCNQ3 I/Imax Kurve um -24mV (s. Kap. 3.5), gegenüber KCNQ5 um -9mV (s. Kap. 3.4). Die Werte für die halbmaximale Aktivierung für KCNQ3 Kanäle (Kontrolle V1/2 = -37,4 ± 1,7 mV; nach Zugabe von 100µM EPX V1/2 = -38,5 ± 0,8 mV) waren nicht mehr signifikant unterschiedlich. 3.7 Elektrophysiologische Eigenschaften von koexprimierten KCNQ5
/KCNE3 Kanälen
Die Untereinheiten der KCNQ5 Kanäle können in Wechselwirkung mit anderen Untereinheiten treten, wie z.B. schon mit KCNQ3 (Wickenden et al. 2001) gezeigt. Die Interaktion des KCNQ5 Kanals mit ß-Untereinheiten wurde bisher kontrovers diskutiert (Schroeder et al. 2000a; Lerche et al. 2000). Eine neue Studie (Roura-Ferrer et al. 2009) hat inzwischen eine mögliche Interaktion von KCNQ5 mit KCNE1 oder KCNE3 Untereinheiten vorgestellt. Demnach kommt die heteromere Konstellation von KCNQ5/KCNE3 im Skelettmuskel und vaskulären glatten Muskelzellen vor. In einer neuen Serie von Experimenten wurden die koexprimierten KCNQ5/KCNE3 Kanalproteine untersucht. Die Auswertungen der Ergebnisse haben vollkommen veränderte Kanaleigenschaften gezeigt. Während die Oozyten, die mit KCNQ5 cRNA injiziert worden waren, langsam aktivierende Ströme aufzeigten (Abb. 3.17 C), konnte bei KCNQ5 und KCNE3 1:10 koinjizierten Oozyten eine wesentlich schnellere Aktivierungskinetik der Ströme beobachtet werden. Ähnlich wie die Ströme der KCNQ1/KCNE3 exprimierenden Oozyten (Abb. 3.17 E) zeigten die KCNQ5/KCNE3 Ströme nach Erreichen ihrer maximalen Stromamplitude einen annähernd zeitunabhängigen Verlauf (Abb. 3.17 A), was sich besonders bei positiven Spannungen bemerkbar machte. Auch die Höhe der Stromamplituden befand sich bei Heteromeren von KCNQ5/KCNE3 und KCNQ1/KCNE3 im vergleichbaren Bereich, während KCNQ5 injizierte Oozyten bis zu 10 fach größere Stromamplituden darstellten. Der Vergleich der normierten Strom-Spannungs-Kurven unter Kontrollbedingungen zeigt, dass KCNQ5/KCNE3 und KCNQ5 injizierte Oozyten Klemmspannungen ein vergleichbares Strom-Spannungs-Verhältnis aufweisen (Abb. 3.17 B, D). Im Bereich negativer Klemmspannungen allerdings zeigt KCNQ5/KCNE3 eine Tendenz zum linearen Strom-Spannungs-Verhältnis, was auch ein typisches Merkmal von KCNQ1/KCNE3 Kanälen ist (Abb. 3.17 F). -100 -80 -60 -40 -20 0 -100 -80 -60 -40 -20 -100 -80 -60 -40 -20 Abbildung 3.17: Gegenüberstellung der KCNQ5/KCNE3, KCNQ5 und KCNQ1/KCNE3 generierten
Ströme.
Typische Stromableitungen einer KCNQ5/KCNE3 (A), KCNQ5 (C) und KCNQ1/KCNE3 (E)
injizierten Oozyte zeigen jeweils einen repräsentativen Stromverlauf unter Kontrollbedingungen. Die Grafiken
B, D und F stellen die Strom-Spannungsbeziehung der jeweiligen Konstrukte dar (KCNQ5/KCNE3 n = 18).
Spannungsprotokolle sind der Abb. 3.1 zu entnehmen.
Zusammenfassend konnte beobachtet werden, dass KCNQ5/KCNE3 koinjizierte Oozyten einen Strom generierten, der im Vergleich zu KCNQ5 Strömen keine langsame Aktivierungskinetik aufwies, wesentlich früher aktivierte (ab -80mV), dafür aber bei etwa +20mV, ähnlich wie der KCNQ5-Strom, einen stationären Zustand erreichte (steady state). Zusätzlich konnte eine Inhibition der Gesamtstromamplitude der koexprimierten KCNQ5/KCNE3 Kanäle gegenüber einzeln exprimierten KCNQ5 Kanälen beobachtet
3.8 Wirkung von Carbamazepin auf KCNQ5/KCNE3 Heteromere;
Vergleich zu Carbamazepin-10,11-Epoxid
Bei positiven Spannungen zeigte das Antikonvulsivum CBZ eine aktivierende Wirkung auf die Gesamsstromamplitude von KCNQ1/KCNE3 Kanälen, während bei stark negativen Spannungen eine Leitwerterniedrigung und eine verminderte Offenwahrscheinlichkeit beobachtet wurde (s.Kap 3.1). Neuronale KCNQ5 Kanäle dagegen wurden in Anwesenheit von CBZ in ihrer Gesamtstromamplitude inhibiert. Eine noch stärkere Inhibition der KCNQ5 Gesamtstromamplitude wurde durch das EPX provoziert, während sich die komplexe Wirkung von EPX auch durch eine erhöhte Offenwahrscheinlichkeit mit Linksverschiebung der I/Imax Kurve zu hyperpolarisierenden Spannungen zeigte (s.Kap.3.4). Wie schon beschrieben, resultiert aus der Koinjektion der Xenopus Oozyten mit KCNQ5 und KCNE3 cRNA ein funktionstüchtiger Kanal, der Ströme generiert, die bis zu 10-fach kleiner sind, als KCNQ5 Ströme. Dabei zeigte sich auch, dass der KCNQ5/KCNE3 Kanal schon ab - 80mV aktiviert wurde. Die experimentelle Überprüfung der pharmakologischen Wirkung von CBZ und EPX auf diese Kanalproteine sollten nun mehr Aufschluss über die Charakteristika dieser koexprimierten Kanäle geben. Die koinjizierten KCNQ5/KCNE3 Oozyten zeigten Ströme, die scheinbar nicht empfindlich auf 100µM CBZ-Lösung reagierten (Abb. 3.18 A, E). Andere Konzentrationen dagegen führten zur deutlichen Veränderung der Stromamplituden. Geringe Konzentrationen (10µM) zeigten einen Anstieg der Ströme, während stärkere Konzentrationen (300µM) eine Inhibition der Stromamplitude provozierten (Abb. 3.18 B, C). A KCNQ5 / KCNE3 + CBZ B KCNQ5 / KCNE3 + CBZ KCNQ5 / KCNE3 + CBZ -100 -80 -60 -40 -20 g at -80mV g at 0mV g at -80mV g at 0mV g at -80mV g at 0mV Abbildung 3.18: Konzentrationsabhängige Wirkung von CBZ auf koexprimierte KCNQ5/KCNE3 Kanäle.
Die Originalströme einer KCNQ5/KCNE3 injizierten Oozyte bei 40mV zeigen nach Zugabe von 100µM CBZ-
Lösung (A) keine Veränderung, während 10µM eine Steigung der Stromamplitude provoziert und 300µM einen
gegenteiligen Effekt bewirkt (B, C). Die Darstellungen des analysierten KCNQ5/KCNE3 Leitwertes bestätigen
diese Befunde (D, E, F). (n = 10)
Auch die Analyse des Leitwertes g bei 0mV bestätigten sowohl einen signifikanten Anstieg bei 10µM CBZ-Lösung (Abb. 3.18 D), als auch eine signifikante Reduktion des Leitwertes dieser Kanalproteine in Anwesenheit von 300µM CBZ-Lösung (Abb. 3.18 F). Im Gegensatz dazu, zeigte sich nach Zugabe einer 100µM EPX-Lösung eine deutliche Reduktion der KCNQ5/KCNE3 Ströme, die auch aus dem Vergleich der Originalableitungen (Abb. 3.19 A, B) zu entnehmen ist. Des Weiteren ist festzustellen, dass die Anwesenheit von EPX eine Aktivierung der Ströme bei stark negativen Klemmspannungen bewirkte, was auch durch die Leitwerterhöhung bei -80mV zum Ausdruck kam (Abb. 3.19 D). In der Darstellung der über einander projizierten Strom-Spannungs-Kurven (Abb. 3.19 C) wurde die Reduktion der Ströme in Anwesenheit von EPX ab einer Spannung von -60mV deutlich. Die Analyse des KCNQ5/KCNE3 Leitwertes zeigte ebenfalls eine signifikante Reduktion bei 0mV (Abb. B KCNQ5 / KCNE3 + EPX C KCNQ5 / KCNE3 + EPX -100 -80 -60 -40 -20 g at -80mV g at 0mV Abbildung 3.19: Wirkung von EPX auf KCNQ5/KCNE3 Kanäle. Die Stromableitungen einer
KCNQ5/KCNE3 injizierten Oozyte (A) zeigen nach Zugabe einer 100µM EPX-Lösung einen deutlichen
Rückgang der Stromamplitude (B). Diese Wirkung wird auch in der Darstellung der Strom-Spannungs-Kurven
eines repräsentativen Experimentes deutlich (C). Die Analyse des Leitwertes der koinjizierten KCNQ5/KCNE3
Kanäle in Anwesenheit von EPX wird in der Grafik D vorgestellt.
Der Vergleich der Wirkung von CBZ und EPX zeigt gegensätzliche Reaktionen der KCNQ5/KCNE3 Kanäle. Die normierten Strom-Spannungs-Kurven auf 40mV unterstreichen die schon beschriebenen Ergebnisse von CBZ (Abb. 3.20 A) und zeigen eine konzentrationsanhängige Wirkung auf KCNQ5/KCNE3 Kanäle. Demgegenüber zeigte sich die Wirkung von EPX weniger konzentrationsabhängig, sondern lenkte die Aufmerksamkeit auf spannungsabhängige Unterschiede (Abb. 3.20 D). Die Gegenüberstellung der KCNQ5/KCNE3 Ströme bei +30mV zeigt nach Zugabe einer 10µM CBZ-Lösung (Abb. 3.20 B) eine signifikante Erhöhung der Stromamplitude um 23%, 10µM EPX-Lösung dagegen eine Reduktion der Stromamplitude um 60% (Abb. 3.20 E). Während das Niveau der EPX Inhibition auch durch stärker konzentriertere EPX-Lösung annährend gleich geblieben ist, zeigte die höchste getestet CBZ-Konzentration (300µM) eine signifikante Inhibition der Ströme bei +30mV um 23%. Auffällig war jedoch, dass nach der Auswaschperiode das Inhibitionsniveau beider Testsubstanzen unverändert blieb (Abb. 3.20 B, E). Der IC50 Wert für EPX lagt bei 3µM. A KCNQ5 / KCNE3 + CBZ KCNQ5 / KCNE3 + CBZ Membranpotenzial KCNQ5 / KCNE3 + CBZ con 10µM 100µM 300µM ncon -100 -80 -60 -40 -20 con 10µM 100µM 300µM ncon D KCNQ5 / KCNE3 + EPX KCNQ5 / KCNE3 + EPX Membranpotenzial KCNQ5 / KCNE3 + EPX con 3µm 10µM 100µM ncon -100 -80 -60 -40 -20 con 3µM 10µM 100µM ncon Abbildung 3.20: Vergleich der Wirkung von CBZ und EPX auf KCNQ5/KCNE3 Kanäle. Normierte
Strom-Spannungs-Kurven zeigen nach Zugabe von CBZ eine konzentrationsabhängige Wirkung (A), die in
Anwesenheit von EPX auch bei kleineren Konzentrationen einen inhibierenden Effekt darstellt (D). Die
Grafiken B und E stellen die Ströme bei +30mV nach Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen der jeweiligen
Testsubstanz dar. Die Wirkung von CBZ (C) und EPX (F) auf das Membranpotenzial zeigt ebenfalls erhebliche
Unterschiede. (CBZ n = 10; EPX n = 6)
Des Weiteren konnte in Anwesenheit von EPX (10µM und 100µM) eine signifikante
Hyperpolarisation des Membranpotenzials beobachtet werden (Abb. 3.20 F). Demgegenüber konnte die 10µM und 100µM CBZ-Lösung keinen Effekt auf das Membranpotenzial erzielen, wobei die Anwesenheit einer 300µM CBZ-Lösung eine leichte, dennoch signifikante Depolarisation der KCNQ5/KCNE3 injizierten Oozyte bewirkte (Abb. 3.20 C). 3.9 Vergleich der Wirkung von Carbamazepin-10,11-Epoxid auf KCNQ5,
KCNQ5/KCNE3 und KCNQ1/KCNE3 Kanäle
Vorangegangene Untersuchungen haben gezeigt, dass die Anwesenheit von EPX eine starke Inhibition der KCNQ5/KCNE3 Stromamplituden vermittelt hat. Dabei konnte beobachtet werden, dass sich bei negativen Klemmspannungen ein gegenteiliger Effekt bemerkbar machte. Diese Beobachtung kann durch die Auswertung der Tail-Ströme, die als apparente Offenwahrscheinlichkeit durch eine I/Imax Kurve dargestellt sind (Abb. 3.21 A), bestätigt werden. Daraus lässt sich ableiten, dass die Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ5/KCNE3 Kanalproteine in Anwesenheit von EPX ganz deutlich ansteigt. Die Berechnung der halbmaximalen Aktivierungsspannung V1/2 = -41,8 ± 3,6 mV für Kontrolle und V1/2 = -57,7 ± 5,8mV in Anwesenheit von 100µM EPX haben eine deutliche Verschiebung der I/Imax Kurve zu negativeren Spannungen gezeigt (3µM V1/2 = -53,7 ± 5,7mV und 10µM V1/2 = -58,5 ± 6,9mV). Die Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ5/KCNE3 Kanäle in Anwesenheit von CBZ wurde dagegen nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt). In Anbetracht der Tatsache, dass Xenopus laevis Oozyten auch einen endogenen xKCNQ1 besitzen (Goldin 1991), wurde auch eine Testreihe mit koinjizierten KCNQ1/KCNE3 Kanälen durchgeführt. Diese Ergebnisse haben allerdings gezeigt, dass die Anwesenheit von EPX weder einen Einfluss auf die Stromamplitude (Daten nicht gezeigt), noch auf die Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ1/KCNE3 Kanäle ausgeübt hat (Abb. 3.21 B). A KCNQ5 / KCNE3 + EPX B KCNQ1 / KCNE3 + EPX C -100 -80 -60 -40 -20 0 -100 -80 -60 -40 -20 0 -100 -80 -60 -40 -20 0 Abbildung 3.21: Gegenüberstellung der Wirkung von EPX auf KCNQ5/KCNE3, KCNQ1/KCNE3 und
KCNQ5 Kanäle.
Die Darstellung der apparenten Offenwahrscheinlichkeit anhand der I/Imax Kurven, die in
dieser Abbildung auf die maximale Amplitude und nicht auf die Werte bei +40mV normiert wurden, zeigen den
unterschiedlichen Einfluss von EPX auf KCNQ5/KCNE3 (A), KCNQ1/KCNE3 (B) und KCNQ5 (C) Kanäle.

Im Gegensatz dazu vermittelte EPX eine erhöhte Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ5
Kanäle, die hier durch eine modifizierte Darstellung der I/Imax Kurven gezeigt wird (Abb. 3.21 C). Die Werte wurden nicht, wie bisher gezeigt, auf +40mV normiert, sondern auf den jeweiligen Maximalwert, da die I/Imax Kurven der KCNQ5 und KCNQ5/KCNE3 Kanäle bei positiven Spannungen einen Inaktivierungsvorgang beschreiben. Zusammengefasst konnte beobachtet werden, dass sowohl KCNQ5 als auch KCNQ5/KCNE3 Kanäle eine Inhibition der Gesamtstromamplitude als Antwort auf die Zugabe von EPX zeigten. Dabei wurde der Strom um bis zu ca. 60% reduziert (10µM und 100µM EPX) (Abb. 3.9 E; Abb. 3.19 E). Bei beiden Kanälen konnte des Weiteren in Anwesenheit von EPX ein erhöhter Leitwert bei -80mV (Abb. 3.7 E; Abb. 3.19 D) und eine Hyperpolarisation der Membran beobachtet werden. Allerdings zeigten KCNQ5/KCNE3 Kanälen nach Inkubation mit EPX eine deutlich höhere Offenwahrscheinlichkeit (Abb. 3.21A) als KCNQ5 Kanäle (Abb. 3.21 C). Diese stärkere Empfindlichkeit der KCNQ5/KCNE3 Kanäle gegenüber dem EPX könnte einen weiteren Hinweis auf eine Interaktion der beiden Untereinheiten darstellen. 4 Diskussion
KCNQ-Kanäle haben eine bedeutende physiologische und pathophysiologische Rolle im menschlichen Organismus (Jentsch, 2000). Durch ihre große funktionelle Vielfalt, die zusätzlich noch durch Assemblierung mit akzessorischen ß-Untereinheiten der KCNE-Familie vervielfacht wird und ihre zahlreiche Lokalisationen in unterschiedlichen Gewebesorten stellt diese Kaliumkanalfamilie eine große Breite an möglichen Angriffspunkten für Medikamente dar. So zeigen sich neuronale KCNQ-Kanäle für die Entwicklung von Medikamenten gegen Krankheiten wie Epilepsie oder chronische Schmerzzustände als viel versprechende Angriffspunkte. Von besonderer Bedeutung ist dabei eine ausschließliche Wirkung auf neuronale KCNQ-Kanäle (KCNQ2-KCNQ5), um KCNQ1 vermittelte, kardiale Nebenwirkungen zu vermeiden (Tatulian et al. 2001). Ein vielseitig eingesetztes Antiepileptikum stellt das Carbamazepin (CBZ) dar. Seine Hauptwirkung beruht auf der Hemmung spannungsgesteuerter Natriumkanäle (Willow et al. 1984), die in großer Dichte mit spannungsgesteuerten KCNQ-Kanälen kolokalisiert sind, besonders am Axonhügel der Neuronen (Maljevic et al. 2008). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine bisher nicht bekannte Wirkung von CBZ auf KCNQ-Kanäle. So konnte auch in Anwesenheit des metabolischen Folgeproduktes Carbamazepin-10,11-Epoxid (EPX), dem ebenfalls antiepileptische Eigenschaften zugesprochen werden (Albright et al. 1984; Bourgeois et al. 1984a), eine starke Wirkung auf KCNQ-Kanäle beobachtet werden. Diese Wirkung war sehr komplex, wobei ganz klar hervorgeht, dass EPX im Vergleich zu CBZ eine viel größere Potenz aufweist. Demgegenüber konnte auch gezeigt werden, dass KCNQ1 generierte Ströme nicht von CBZ beeinflusst 4.1 Untersuchungen von KCNQ- Kanälen im Expressionssystem der Oozyte
Das in dieser Arbeit gewählte Expressionssystem der Xenopus Oozyte bietet neben einer recht unkomplizierten Handhabung der Versuchstiere und einer gut erlernbaren Technik der Gewinnung einer großen Anzahl an Oozyten auch eine gut etablierte Methode zur pharmakologischen Untersuchung an ausgewählten Ionenkanälen (Dascal 1987). Ein Nachteil zeigt sich allerdings durch die Größe der Oozyte und der dadurch bedingten großen Kapazität ihrer Plasmamembran (Goldin 1991). Aus diesem Grund stellt sich das Membranpotenzial nicht sofort nach Anlegen eines Kommandopotenzials ein. Die Kapazitäten können zwar am Verstärker kompensiert werden, aber es bleibt sehr schwierig, Ströme innerhalb der ersten Millisekunden nach einem Spannungssprung zu messen. Dieser Umstand wurde insbesondere bei der Analyse der Tail-Ströme berücksichtigt indem der Zeitpunkt der zu analysierenden Tail-Ströme außerhalb dieser kapazitiven Transienten gelegt wurde. An dieser Stelle sollte auch Eigenkritik geäußert werden. Üblicherweise verwendet man für die Analyse der Tail- Ströme ein Spannungsprotokoll, das wesentlich negativere Spannungen beschreibt (z.B. -140mV bis +40mV), um so z.B. Spannungsverschiebungen zu negativeren Potenzialen besser darstellen zu können. Für die meisten Experimente war zwar das gewählte Spannungsprotokoll beginnend ab -90mV für die Darstellung der I/Imax Kurve ausreichend, für den koexprimierten KCNQ5/KCNE3 Kanal hätte man sich jedoch ein etwas größeres Spannungsfenster wünschen können. Des Weiteren soll an dieser Stelle die Bedeutung der endogenen Proteine der Oozyten diskutiert werden. So besitzen die Xenopus laevis Oozyten endogene xKCNQ1 Kanäle, die z.B. bei der Koexpression von KCNQ5 und KCNE3 Kanälen eine relevante Rolle spielen könnten. Bei starker Expression eines bestimmten Kanalproteins ist der Strom durch den zu untersuchenden Ionenkanal dominierend (Schwake et al. 2010), was bedeutet, dass der gemessene Strom fast ausschließlich auf den gewünschten Kanal zurückzuführen ist. Die Ergebnisse der pharmakologischen Untersuchung von CBZ zeigen außerdem, dass H2O injizierte Oozyten nicht von CBZ oder EPX beeinflusst werden. Auch KCNQ1 injizierte Oozyten zeigen keine Änderungen der Parameter in Anwesenheit von CBZ. Allerdings ist es denkbar, dass es bei einer Koinjektion von KCNQ5/KCNE3 möglicherweise zu einer Interaktion zwischen KCNE3 und dem endogenen xKCNQ1 kommen könnte. Am Beispiel der Entdeckung von KCNE1, der interessanterweise acht Jahre vor der Entdeckung von KCNQ1 kloniert wurde (Takumi et al. 1988), konnte gezeigt werden, dass KCNE1 mit dem endogenen xKCNQ1 assemblieren kann. Damals konnte man sich nicht erklären, wie so ein kleines Protein in Xenopus laevis Oozyten einen großen, spannungsabhängigen und sehr langsam aktivierenden Kaliumstrom induzieren konnte und warum dieser Strom in keinem anderen Expressionssystem zu beobachten war. Heute weiß man, dass KCNE1 nicht selbst einen Kanal bilden kann, sondern mit KCNQ1 assoziiert, um einen heteromeren Kanal zu formen (Barhanin et al.1996; Sanguinetti et al.1996). Auf der anderen Seite zeigt eine ganz neue Studie (Roura-Ferrer et al.2009), dass KCNQ5 mit anderen KCNE-Untereinheiten funktionstüchtige Kanäle bildet. So zeigt Roura-Ferrer et al., dass KCNQ5 koinjiziert mit KCNE3 sowohl im Expressionssystem der Oozyte als auch in HEK-293-Zellen einen Kanal bilden, der verglichen mit homomeren KCNQ5, eine mehr als 60% niedrigere Stromamplitude aufweist und bei stark negativen Spannungen schneller aktiviert. Diese Befunde stehen in Übereinstimmung mit den gezeigten Ergebnissen dieser Arbeit. Des Weiteren wird schon seit der Klonierung von KCNQ5 über die physiologische Rolle akzessorischer KCNE-Untereinheiten kontrovers diskutiert (Schroeder et al.2000b; Lerche et al.2000). Während Lerche et al. der tatsächliche Beweis für die Interaktion mit KCNE- Untereinheiten noch fehlt, bezweifelt Schroeder et al. überhaupt die physiologische Relevanz dieser Konstellationen auf Grund fehlender Präsenz der KCNE-Untereinheiten im neuronalen Gewebe und in der Muskulatur. Heutzutage liegt eine Vielzahl an Beweisen für eine Relevanz dieser Interaktion vor. So wurde KCNE1 mRNA in der Skelettmuskulatur der Maus mittels PCR nachgewiesen (Lesage et al. 1992). Des Weiteren konnte eine Expression von allen KCNE- Untereinheiten und KCNQ5 in vaskulären glatten Muskelzellen nachgewiesen werden (Yeung et al. 2007) und eine pathophysiologische Bedeutung der KCNE3 Untereinheit in muskulärem Gewebe zeigte sich durch Mutationen in dieser akzessorischen Untereinheit, die zu periodischen Paralysen führen kann (Abbott et al. 2001). Eine Assemblierung von KCNQ5 und KCNE3 ist also durchaus denkbar, was durch Studien an HEK-293-Zellen bekräftig wird (Roura-Ferrer et al.2009). Einen weiteren Hinweis könnten auch die Ergebnisse dieser Arbeit liefern, die zeigen, dass KCNQ1/KCNE3 Kanäle nicht sensitiv auf EPX reagieren, während KCNQ5/KCNE3 injizierte Oozyten in Anwesenheit von EPX eine wesentlich größere Offenwahrscheinlichkeit und eine Linksverschiebung der Aktivierungskurve aufzeigen, die sich in ihrer Größe deutlich von KCNQ5 injizierten Oozyten unterscheiden. 4.2 Akzessorische KCNE-Untereinheiten steigern die Empfindlichkeit auf
Auf der Suche nach einem mutierten Protein, das verantwortlich für die Entstehung der hereditären Form des Long-QTSyndroms ist, wurde 1996 der spannungsabhängige Kaliumkanal KCNQ1 kloniert. Das inzwischen sehr gut untersuchte Beispiel der Interaktion von KCNQ1 und der akzessorischen KCNE1-Untereinheit zeigt die physiologische Bedeutung in der Repolarisationsphase des kardialen Aktionspotenzials. Mutationen in einer der beiden Untereinheiten können zu kardialen Arrythmien (Long-QTSyndrom) und in Abhängigkeit vom Erbgang auch noch zusätzlich zu kongenitaler Taubheit (JLN-Syndrom) führen (Barhanin et al.1996; Sanguinetti et al. 1996). Diesem heteromeren Kaliumkanal liegt demnach die Entstehung des kardialen Iks-Stroms zugrunde. Dieser Iks-Strom zeichnet sich durch eine langsame Aktivierung durch die Depolarisation der Membran aus, die zur Beschleunigung der Repolarisation der Kardiomyozyten in der dritten Phase des Aktionspotenzials führt. Die Koexpression von KCNQ1/KCNE1 im Innenohr steht im Zusammenhang mit der Endolymphproduktion (Rivas, Francis 2005; Warth, Barhanin 2002) In dieser Arbeit wurde die Wirkung von CBZ auf diesen Kanal untersucht. Dabei zeigte sich, dass der homomere KCNQ1 Kanal nicht von CBZ beeinflusst wurde, während bei Koexpression mit KCNE1 ein Anstieg der Stromamplitude bei positiven Spannungen in Anwesenheit von CBZ beobachtet werden konnte. Dieser Anstieg der Ströme kann mit einem signifikant erhöhten Leitwert der KCNQ1/KCNE1 exprimierenden Oocyte bei +30mV erklärt Interessant in diesem Zusammenhang ist das häufig beschriebene Phänomen einer CBZ induzierten Bradykardie (Arhan et al. 2009; Kasarskis et al. 1992; Kaul et al. 2000), die sowohl bei therapeutischen Dosierungen, als auch bei Überdosierungen beobachtet wird. Andere Studien, die an Hunden durchgeführt wurden zeigen ebenfalls, dass CBZ in strukturell gesundem kardialen System bradykarde Symptome auslösen kann (Steiner et al. 1970). Des Weiteren scheint die Einnahme von CBZ auch das auditorische System zu beeinflussen. De la Cruz et al. beschreibt, dass CBZ eine temporäre, bilaterale Taubheit nach Überdosierung induzieren kann (de la et al. 1999). Der Befund der Aktivierung des KCNQ1/KCNE1 Kanals in Anwesenheit von CBZ wurde bei einer Konzentration von 100µM CBZ (23mg/l) beobachtet, die sich außerhalb der therapeutischen Dosierung befindet. So verdeutlichen die Ergebnisse dieser Arbeit und die vorgestellten Studien noch einmal wie wichtig die richtige Einstellung des therapeutischen Bereiches und eine regelmäßige Kontrolle des Serumspiegels bei CBZ Patienten sind. Die Koexpression von KCNQ1/KCNE3 zeigte in Anwesenheit von CBZ ebenfalls eine signifikante Aktivierung der Ströme bei positiven Spannungen. Allerdings vermittelte CBZ bei negativen Spannungen eine verminderte Offenwahrscheinlichkeit, die von einem signifikant erniedrigten Leitwert bei -80mV begleitet wurde. Diese Befunde weisen auf eine spannungsabhängige Wirkung von CBZ hin. Diese spannungsabhängige CBZ Wirkung wird ebenfalls auf spannungsabhängige Na+-Kanäle beschrieben (Willow et al. 1985), die den Hauptangriffspunkt in der antikonvulsiven Behandlung mit CBZ darstellen. KCNQ1/KCNE3 Kanäle befinden sich vermehrt in Kolonkrypten, wo sie in die Cl- -Sekretion involviert sind (Schroeder et al. 2000b; Greger et al. 1997; Bleich et al. 1997). Studien zeigen, dass die spezifische Hemmung dieser cAMP-abhängigen Kaliumkanäle mit dem Wirkstoff 293B zum fast kompletten Abfall elektrogener Cl- - Sekretion führen kann (Warth et al. Ussing-Kammer Untersuchungen an isolierten Kolongewebestücken (Sievers, 2008) zeigen eine konzentrationsabhängige Inhibition der cAMP-vermittelten Cl- - Sekretion in Anwesenheit von CBZ. Dabei konnte im zeitlichen Verlauf ein initial aktivierender Effekt, gefolgt von einer stärkeren Inhibition beobachtet werden. Diese Befunde liesen sich durch weitere Analysen zellulärer Mechanismen auf eine CBZ vermittelte Reduktion der cAMP- Konzentration und einer kurzfristigen Steigerung der Ca2+-Aktivität zurückführen. Weitere Studien zeigen ebenfalls, dass CBZ die cAMP-Produktion hemmen kann (Chen et al. 1996), indem CBZ die Forskolin-induzierte Phosphorylierung des CREP (cAMP response element binding protein), das für die Aktivierung der Adenylatcyclase (AC) notwendig ist, inhibiert. Diese Befunde können auch im Zusammenhang mit den gezeigten Ergebnissen der vorliegenden Arbeit gebracht werden. So ist anzunehmen, dass der verminderte Leitwert und die reduzierte Offenwahrscheinlichkeit der KCNQ1/KCNE3 Kanäle nach Zugabe von CBZ durch die Reduktion der cAMP-Konzentration erklärt werden kann. Demzufolge vermittelt CBZ die Inhibition der cAMP-vermittelten Cl- - Sekretion indirekt auch über den cAMP- abhängigen KCNQ1/KCNE3 Kaliumkanal. Dass second Messenger wie cAMP im Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyte zur Verfügung stehen, zeigen zahlreiche Studien, die Rezeptoren in der Membran der Oozyte identifiziert haben, die über diesen second Messenger fungieren (Lotan et al. 1982; Sumikawa et al. 1984; Woodward et al. 1987). Der bei positiven Spannungen beobachtete aktivierende Effekt von CBZ zeigt die Komplexität der Wirkung dieses Pharmakons. Zusätzlich zur Aktivierung, verändert CBZ die Aktivierungskinetik dieser Kanäle (Zeitkonstante signifikant erniedrigt). Die Zunahme der Stromamplitude kann mit dem gesteigerten Leitwert bei 0mV und +30mV erklärt werden. Diese Befunde könnten einen Hinweis auf eine direkte Wirkung an KCNQ1/KCNE3 Kanälen darstellen, wobei ein weiteres, in die CBZ Wirkung involviertes System nicht ausgeschlossen Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Assemblierung von KCNQ1 mit akzessorischen Untereinheiten wie KCNE1 und KCNE3 die pharmakologischen Eigenschaften dahingehend verändert, dass die Empfindlichkeit auf das Antikonvulsivum 4.3 Vergleich der Wirkung von CBZ und EPX
Das trizyclische Antikonvulsivum CBZ und sein metabolisches Folgeprodukt EPX zeigen unterschiedlich starke Wirkungen auf neuronale KCNQ Kanäle (s. Ergebnisse). CBZ stellt das Mittel der ersten Wahl in der Behandlung von partiellen und tonisch-clonischen Krämpfen dar (Bertilsson et al. 1986). Bei Monotherapie mit CBZ wird ein therapeutischer Bereich von 4-12 mg/l empfohlen. Höhere Konzentration führen häufig zu Nebenwirkungen, die sogar die Krampfbereitschaft verstärken können (Bridge et al. 1994; Schmidt et al. 1995). Der Wirkmechanismus von CBZ ist bisher nur teilweise geklärt. CBZ stabilisiert übererregte Nervenmembranen und hemmt Entladungen von Nervenzellen. Damit wird die Krampfschwelle angehoben, sowie die Schmerzüberleitung vermindert. CBZ entfaltet seine Hauptwirkung auf neuronale spannungsabhängige Na+-Kanäle (Willow et al. 1985). Außerdem wird auch eine inhibitorische Wirkung auf spannungsanhängige Ca2+ Kanäle beschrieben (Schirrmacher et al. 1993; Walden et al. 1993). Auf diese Weise scheint CBZ dem Anstieg der intrazellulären Ca2+ -Konzentration in Nervenzellen während epileptischer Aktivität entgegenzuwirken (Wiemann et al. 1996). Auch das metabolische Folgeprodukt EPX weist antiepileptische Eigenschaften auf (Albright, Bruni 1984; Bourgeois et al. 1984b). Dabei werden häufig Nebenwirkungen im Zusammenhang mit einer erhöhten Konzentration dieses Metaboliten gebracht. So wird während einer CBZ Therapie ein Plasmakonzentrationsverhältnis von etwa 1:10 bis 1:5 (EPX:CBZ) angegeben, wobei Kombitherapien das Verhältnis zugunsten des EPX verändern können, was mit erheblichen Nebenwirkungen einher gehen kann (Schoeman et al. 1984). Des weiteren zeigt sich eine lineare Beziehung zwischen der Gehirn- und Plasmakonzentration sowohl von CBZ als auch von EPX (Morselli et al. 1977). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine bisher nicht beschriebene Wirkung von CBZ und EPX auf neuronale KCNQ-Kaliumkanäle. Dabei konnten erhebliche Unterschiede in der Wirkung dieser beiden Testsubstanzen beobachtet werden: 1) Während CBZ die Offenwahrscheinlichkeit der neuronalen Kaliumkanäle nicht, bzw. nur sehr geringfügig (KCNQ5/KCNQ3) beeinflusste, zeigte sich in Anwesenheit von EPX bei allen getesteten neuronalen KCNQ-Kanälen eine erhöhte Offenwahrscheinlichkeit und eine Verschiebung der halbmaximalen Aktivierungsspannung in Richtung hyperpolarisierende Spannungen. 2) Die erhöhte Offenwahrscheinlichkeit nach Zugabe von EPX wurde von signifikanter Hyperpolarisation der Membran begleitet, während CBZ keinen Einfluss auf die Membranspannung ausgeübt hat. 3) Des Weiteren zeigte sich bei depolarisierenden Spannungen eine zusätzliche inhibitorische Wirkung auf die Stromamplituden in Anwesenheit von EPX, mit Ausnahme der KCNQ3 Kanäle, wobei die Zugabe von niedrig konzentrierten CBZ-Lösungen bei KCNQ5/KCNQ3 und KCNQ5/KCNE3 Kanälen einen gegenteiligen, aktivierenden Effekt auf die Stromamplituden bewirkte. 4) Einen weiteren Unterschied stellt der IC50 Wert dar. (Dieser wurde aus den Konzentrations-Wirkungs Kurven unter der Annahme einer maximalen Hemmung von 100% des Stromes errechnet und damit im Zweifelsfall sogar überschätzt.) So zeigte sich bei KCNQ5 Kanälen bei stark depolarisierenden Spannungen eine Inhibition der Stromamplituden, sowohl mit CBZ als auch EPX behandelten Kanälen. Während jedoch der IC50 Wert von CBZ deutlich größer 300µM einzugrenzen ist, zeigt EPX einen IC50 kleiner 10µM (2,3mg/l). Bei heteromeren Kanälen wie KCNQ5/KCNQ3 und KCNQ5/KCNE3 lässt sich in Anwesenheit von EPX sogar der IC50 Wert ≤ 3µM (≤ 0,7 mg/l) eingrenzen, wobei die Zugabe von EPX bei KCNQ5/KCNQ3 Kanälen scheinbar eine maximale Inhibition der Ströme um 30% bewirkte. Die neuronalen KCNQ-Kanäle haben ihre physiologische Bedeutung in der Aufrechterhaltung und Wiederherstellung des Ruhemembranpotenzials. Ein Verlust oder die Reduktion ihrer Aktivität kann zur neuronalen Übererregbarkeit führen, die als Entstehungsursache epileptischer Krampfanfälle angesehen wird. Dieser Zusammenhang zeigt sich auch bei Mutationen der KCNQ2 und KCNQ3 Kanäle, die zur Entstehung einer Form frühkindlicher Epilepsie (BFNC) führen (Biervert et al. 1998). Diese Kanäle, genau so wie KCNQ4 und KCNQ5, tragen zu dem durch Muskarin aktivierbaren K+ -Strom (sog. M- Strom) bei, der eine wichtige Rolle bei der Regulation der Erregbarkeit von Neuronen spielt. In diesem Zusammenhang könnten die vorgestellten Ergebnisse, die auf eine sehr komplexe Wirkung von EPX und CBZ hindeuten, einen begründeten Hinweis auf das so enge therapeutische Fenster liefern. Da sich in Anwesenheit von EPX zusätzliche Veränderungen der Aktivierungsparameter zeigen, könnte das in Übereinstimmung mit der in der Literatur beschriebenen antiepileptischen Wirkung, die bei EPX vermutet wird, stehen. Zusätzlich zeigt sich auch in Anwesenheit von CBZ eine Aktivierung von KCNQ3, KCNQ5/KCNQ3 und KCNQ5/KCNE3 Strömen bei positiven Spannungen, allerdings nur bei Konzentrationen (3µM und 10µM), die sich im therapeutischen Bereich befinden. Höhere Konzentrationen von CBZ scheinen einen gegenteiligen Effekt an diesen Kanälen zu bewirken, was wiederum für den empfohlenen therapeutischen Bereich sprechen würde. Eine Ausnahme scheint der KCNQ3 Kanal darzustellen, der auch bei höheren Konzentrationen beider Testsubstanzen einen Anstieg der Stromamplituden zeigte. Neben den Befunden, die Hinweise auf eine unterstützende antikonvulsive Wirkung von CBZ und EPX auf neuronale KCNQ Kanäle hindeuten, könnten die inhibitorischen Komponenten der CBZ und EPX vermittelten Wirkung möglicherweise eine Begründung für die beobachteten Nebenwirkungen, wie die Verstärkung der Krampfbereitschaft bei Überdosierung (Bridge et al. 1994; Schmidt et al. 1995) darstellen. Die höhere Empfindlichkeit der neuronalen KCNQ Kanäle auf das EPX kann die Notwendigkeit einer regelmäßigen Kontrolle der CBZ:EPX Verhältnisse unterstreichen. So korrelieren Veränderungen, die ein zugunsten von EPX verschobenes CBZ:EPX Verhältnis aufweisen oder größere absolute Konzentration von EPX im Plasma zeigen, mit klinischen Nebenwirkungen (Schoeman et al. 1984). Es ist daher sehr wichtig bei Therapieansetzen, besonders bei Kombinationstherapien, eine regelmäßige Kontrolle beider Wirkspiegel zu überprüfen. 4.4 Bedeutung der CBZ und EPX Wirkung auf neuronale KCNQ Kanäle
Ströme durch neuronale KCNQ-Kanäle weisen durch ihre biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften sowie ihr neuronales Expressionsprofil Übereinstimmungen mit dem sog. M-Strom auf und werden als das molekulare Korrelat dieses Stroms angesehen (Schroeder et al. 2000a). Der M-Strom wird durch die auswärtsgerichteten K+-Ströme, die unterhalb des Schwellenwertes unmittelbar vor Auslösung eines Aktionspotenzials von Bedeutung sind, repräsentiert. Er spielt eine dominante Rolle bei der Kontrolle neuronaler Erregbarkeit und der Abstimmung der Feuerverhaltens von Neuronen (Halliwell et al. 1982). Zahlreiche Rezeptoren und second Messenger werden als Modulatoren des M-Stroms diskutiert. So scheint die intrazelluläre Ca2+ Konzentration einen Einfluss auf den makroskopischen Strom auszuüben (Marrion 1997b). Weitere evidente Einflüsse auf dem M-Stom wurden durch intrazelluläres cAMP (Schroeder et al. 1998) und membrangebunderes Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat (PIP2) (Suh et al. 2002) gezeigt. Da Carbamazepin, wie zahlreiche Studien zeigen, die cAMP Konzentration reduzieren kann, was höchstwahrscheinlich über eine direkte Wirkung auf die Adenylatzyklase (AC) vermittelt wird (Mann et al. 2009; Montezinho et al. 2007), ist es nicht unwahrscheinlich, dass die gezeigte Reduktion der Stromamplitude der KCNQ2/KCNQ3 Kanäle in Anwesenheit von CBZ, auf diesen Wirkmechanismus zurückzuführen ist. Schroeder et al. konnte zeigen, dass die Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration einen Anstieg der KCNQ2/KCNQ3 Ströme vermitteln kann. Das wäre im Umkehrschluss mit den Befunden und der Schlussfolgerung in Einklang zu bringen. Interessanterweise ergänzen Schroeder et al. ihre Ergebnisse durch einen Hinweis, dass der cAMP vermittelte Effekt in Abhängigkeit von einer intakten Phosphorylierung des N-Terminus der KCNQ2 Untereinheit steht. Die Ergebnisse der pharmakologischen Wirkung von CBZ auf homomere KCNQ3 Kanäle zeigten eine Aktivierung der Stromamplitude, was gegen einen über cAMP vermittelten Effekt und eher für eine direkte kanalvermittelte Wirkung sprechen würde. Die Stromamplitude der homomeren KCNQ2 Kanäle blieb nach Zugabe von CBZ unverändert. Es kann darüber nur spekuliert werden, ob die Befunde an homomeren Kanälen eine kanalvermittelte Wirkung darstellen und ob eine Assemblierung dieser Untereinheiten molekulare Gegebenheiten schafft, die für eine cAMP vermittelte Wirkung von Notwendigkeit sind. Pharmakologische Untersuchungen der homomeren KCNQ5 Kanäle und heteromere Konstellation wie KCNQ5/KCNQ3 und KCNQ5/KCNE3 zeigen eine spannungsabhängige Wirkung von CBZ und EPX. Diese komplexe Wirkung lässt sich in zwei gegensätzliche Reaktionen einteilen. Eine Aktivierung der Kanäle bei stark negativen Spannungen, die durch eine erhöhte Offenwahrscheinlichkeit, einer Verschiebung der Spannungsabhängigkeit zu hyperpolarisierenden Spannungen und einer signifikanten Hyperpolarisation vermittelt wird und ein zweiter Effekt, der besonders bei mittleren und positiven Spannungen eine signifikante Inhibition der Stromamplitude bewirkt. Die antikonvulsive Wirkung beider Testsubstanzen würde die aktivierenden Befunde gut unterstützen. Angelehnt an das Wirkprofil von Retigabin, das seine antikonvulsive Wirkung durch eine direkte, kanalvermittelte Aktivierung von neuronalen KCNQ Kanälen entfaltet (Schenzer et al. 2005; Wickenden et al. 2000; Wickenden, Zou, Wagoner, Jegla 2001) könnten Gemeinsamkeiten möglicherweise auf einen ähnlichen Mechanismus hindeuten. Retigabin aktiviert alle neuronalen KCNQ Kanäle (KCNQ2-KCNQ5), wobei die gesteigerte Aktivität auf die Erhöhung der maximalen Offenwahrscheinlichkeit und eine Verschiebung der Spannungsabhängigkeit zu hyperpolarisierenden Spannungen zurückzuführen ist (Tatulian et al. 2001; Tatulian et al. 2003; Wickenden et al. 2001). Diese Befunde konnten in einer abgeschwächten Form auch in Anwesenheit von EPX beobachtet werden (KCNQ2 und KCNQ2/KCNQ3 nicht getestet). Weitere Gemeinsamkeit ist die fehlende Wirkung auf KCNQ1 Kanäle. Eine sehr offensichtliche Wirkung allerdings unterscheidet diese antikonvulsiven Präparate. Während Retigabin eine ganz eindeutige Aktivierung der Gesamtstromamplitude vermittelt (Wickenden et al. 2001), zeigt die Anwesenheit von EPX eine starke Inhibition der Stromamplituden der KCNQ5, KCNQ5/KCNQ3 und KCNQ5/KCNE3 Kanäle. Auch die Anwesenheit von CBZ hemmt die Stromamplitude dieser Kanäle, allerdings bei höheren Konzentrationen. Es kann darüber spekuliert werden, ob diese Inhibition eine spannungsabhängige Wirkung von EPX und CBZ darstellt, oder womöglich sekundäre Botenstoffe in diese Wirkung involviert sein könnten. Eine direkte Schlussfolgerung auf den Wirkmechanismus erlauben die Befunde jedoch nicht. Die Vermittlung der inhibitorischen Wirkung (bei KCNQ5, KCNQ5/KCNQ3 und KCNQ5/KCNE3 Kanälen) über die Konzentration von cAMP scheint allerdings unwahrscheinlich. Dafür spricht 1) dass die basale cAMP Konzentration der Xenopus laevis Oozyte höchstwahrscheinlich nicht den Umfang der beobachteten Inhibition (bis zu 60%) induzieren kann. 2) Diese Inhibition wurde sowohl in Anwesenheit von CBZ als auch von EPX beobachtet, wobei CBZ bei niedrigeren Konzentrationen eine leichte Aktivierung (KCNQ5/KCNQ3 und KCNQ5/KCNE3) der Stromamplitude zeigte. 3) Die Anwesenheit von EPX zeigt keinen Einfluss auf cAMP-abhängige KCNQ1/KCNE3 Kanäle. 5 Zusammenfassung
KCNQ-Kanäle haben eine bedeutende physiologische und pathophysiologische Rolle im menschlichen Organismus. Ihre funktionelle Vielfalt wird zusätzlich noch durch Assemblierung mit verschiedenen akzessorischen ß-Untereinheiten der KCNE-Familie erweitert. Diese Kaliumkanalfamilie ist Angriffspunkt für zahlreiche Medikamente und erklärt ihre Wirkung bzw. Nebenwirkungen. Carbamazepin (CBZ) ist ein Antikonvulsivum und wird seit den 50er Jahren des letzen Jahrhunderts zur Behandlung fokaler und sekundär generalisierter Anfälle eingesetzt. Das Anwendungsspektrum ist vielseitig und reicht von der Behandlung psychiatrischer Erkrankungen wie akute Manien bis hin zum Diabetes insipidus centralis. Der bisher bekannte Wirkungsmechanismus von Carbamazepin beruht hauptsächlich auf einer reversiblen Bindung an spannungsgesteuerte Na+-Kanäle, wobei repetitive neuronale Entladungen gehemmt werden. In Neuronen, besonders am Axonhügel sind diese Na+-Kanäle in großer Dichte mit spannungsgesteuerten KCNQ-Kanälen kolokalisiert. Ein metabolisches Folgeprodukt von CBZ ist das Carbamazepin-10-11-Epoxid (EPX), dem ebenfalls antiepileptische Eigenschaften zugesprochen werden. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit war die Wirkung von CBZ und EPX auf KCNQ Kanäle. Im Expressionsmodel der Xenopus laevis Oozyte mit Hilfe der Zwei-Elektroden- Spannungsklemmtechnik wurden pharmakologische und funktionelle Untersuchungen der KCNQ Kanäle vorgenommen, die zu folgenden Ergebnissen geführt haben: 1) CBZ übte keinen Einfluss auf KCNQ1 Kanäle aus. Die Verbindung mit den ß- Untereinheiten KCNE1 und KCNE3 änderte die pharmakologischen Eigenschaften dahingehend, dass eine Aktivierung der Ströme bei positiven Spannungen beobachtet werden konnte. Gleichzeitig zeigte sich eine inhibitorische Wirkung von CBZ auf KCNQ1/KCNE3 Kanäle bei negativen Spannungen. EPX zeigte keinen Einfluss auf KCNQ1/KCNE3 Kanäle. 2) Die Wirkung von CBZ und EPX auf neuronale KCNQ Kanäle war komplex. Im therapeutisch relevanten Konzentrationsbereich führte EPX zu einer Aktivierung der neuronalen KCNQ Kanäle durch eine größere Offenwahrscheinlichkeit bei negativen Spannungen, einer Linksverschiebung der Aktivierungskurve und signifikant erhöhtem Leitwert, begleitet von einer Hyperpolarisation der Membran. Diese Befunde waren bei KCNQ5/KCNQ3 und KCNQ5/KCNE3 Kanälen am stärksten ausgeprägt. Gleichzeitig zeigte sich eine inhibitorische Wirkung von CBZ und EPX auf die Stromamplituden bei mittleren und positiven Spannungen. In diesem Spannungsbereich war der Leitwert dieser neuronalen KCNQ Kanäle signifikant erniedrigt. Diese Inhibition wurde allerdings nicht bei homomeren KCNQ2 und KCNQ3 Kanälen beobachtet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals, dass CBZ und sein Metabolit EPX ihre Wirkung auch auf KCNQ Kanäle entfalten. Eine wesentlich potentere Wirkung wurde dabei für den Metaboliten EPX festgestellt. Die Beobachtung der Aktivierung der neuronalen KCNQ Kanäle bei negativen Spannungen könnte dazu beitragen, die antikonvulsive Wirkung dieses Medikaments besser zu verstehen. Gleichzeitig deutet die inhibitorische Wirkkomponente darauf hin, dass der ausgewählte therapeutische Konzentrationsbereich streng limitiert werden muss, um unerwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden. 6 Literaturverzeichnis
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Danksagung

An dieser Stelle möchste ich mich ganz herzlich bei Prof. Dr. Markus Bleich für die
Möglichkeit der Anfertigung dieser Doktorarbeit bedanken. Vielen Dank für das Vertrauen, die Geduld und all die herausfordernden Aufgabestellungen, an den ich sowohl fachlich als auch persönlich wachsen konnte. Dr. Nina Himmerkus und Dr. Birte Sievers bin ich zu großem Dank verpflichtet, für die große Hilfsbereitschaft, gute Ratschläge und die gute Arbeitsatmosphäre im Labor. Mein Großer Dank geht auch an das biochemische Institut. Ganz besonders möchte ich Herrn Dr. Michael Schwake für die Bereitstellung der Konstrukte, die Einführung in die Oozytenexperimente und die geduldige Betreuung bedanken. Bei Katharina Stiebelings möchte ich mich für die herzliche Betreuung und Hilfbereitschaft im Labor bedanken. Nicht zu vergessen ist die gute Zusammenarbeit mit Dr. Christian Beimgraben, der mir mit Rat und Tat zur Seite stand. Vielen Dank dafür! Ohne meine Familie wäre das alles nicht möglich. Der größte Dank geht an meine Eltern, den ich für mein Leben, für das ermöglichte Studium und den Glauben an mich danken möchte. Mit Euch ist meine Grenze der Himmel! Ein besonderer Dank geht auch an die besten Schwiegereltern der Welt! Meiner zweiten Hälfte, meinem Mann, möchte ich meinen tiefsten Dank aussprechen. Ich danke ihm für seine aufrichtige Liebe, seine Geduld, die ehrliche Kritik und seine Kraft mich so zu nehmen wie ich bin. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Olga Haferkamp, geb. Jagodin Rita-Bardenheuer-Str.1, 28213 Bremen Geburtsdatum u.-ort: 02.01.1982 in Kiew (Ukraine) Staatsangehörigkeit:
Schulische Ausbildung
1989
Einschulung in ein musikalisches Internat in Kiew Moabiter-Grundschule in Berlin Musikalische Ausbildung (Jungstudentin) an der Carl- Philipp-Emanuel-Bach-Oberschule in Berlin Kippenberg-Gymnasium Bremen , Abitur
Beruflicher Werdegang
Sep 2002- März 2003
Zahntechnisches Praktikum bei Feldmann & Partner in Zahnmedizinstudium an der Christian-Albrechts- Universität zu Kiel August 2005-2008 Studentisch-wissenschaftliche Mitarbeiterin und Doktorandin am Physiologischen Institut bei Prof. Bleich in Kiel (Abschluss des experimentellen Abschnitts) Februar/März 2008 Praktikum bei Prof. Bremerich, Mund-Kiefer- Gesichtschirurgie am Klinikum Bremen Mitte Zahnärztliches Praktikum in der Praxis Dr. Stahlberg & Staatsexamen Zahnmedizin (Gesamtnote: 1,7) Januar 2009 bis heute Weiterbildungsassistentin für Oralchirurgie in der Praxis Dr. Menke und Partner Okt. 2009-Dez. 2010 Wiederaufnahme der Tätigkeit in der Praxis Dr.Menke
Weitere Auszeichnungen und Tätigkeiten
1989-2002
Solide musikalische Ausbildung (Klavierausbildung) Mehrfache Preisträgerin bei Jugend Musiziert Referententätigkeit im Rahmen eines Kolloquiums, Physiologisches Institut CAU-Kiel Wissenschaftlicher Vortrag und Posterpräsentation, Acta Physiologica, The Federation of European Physiological Societies, München Abbott GW, Butler MH, Bendahhou S, Dalakas MC, Ptacek LJ, Goldstein SA. MiRP2 forms potassium channels in skeletal muscle with Kv3.4 and is associated with periodic paralysis. Cell 2001;104:217-31. Albright PS, Bruni J. Effects of carbamazepine and its epoxide metabolite on amygdala- kindled seizures in rats. Neurology 1984;34:1383-86. Arhan E, Aycicek S, Akaln N, Guven A, Kose G. Cardiac effects of carbamazepine treatment in childhood epilepsy. Neurologist 2009;15:268-73. Ballenger JC, Post RM. Carbamazepine in manic-depressive illness: a new treatment. Am J Psychiatry 1980;137:782-90. Barrons R, Roberts N. 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ORIGINAL INVESTIGATION Pregnancy Outcome Following GestationalExposure to Echinacea A Prospective Controlled Study Michael Gallo, BSc; Maumita Sarkar, BSc; Waisze Au, BSc; Kimberlee Pietrzak, MD; Beatriz Comas, MD;Michael Smith, MD; Thomas V. Jaeger, PhD; Adrienne Einarson, RN; Gideon Koren, MD Background: Echinacea products are among the most

Aiba medical handbook 2009 except foreword (2).pdf

MEDICAL COMMISSION OF THE INTERNATIONAL BOXING ASSOCIATION (AIBA) SEVENTH EDITION 2009 Electronic adaptation Editor's Note _ 3 Foreword 4 The Medical Commission and the Medical Jury 6 Disqualifying Conditions _ 7 Medical Examinations _ 8 Medical Responsibilities of the Ringside Physician _ 10